Nossa técnica permite a imagem precisa de células imunes humanas acumuladas pelo pulmão em condições inflamatórias in vivo fornecendo insights emocionantes sobre o processo de localização pulmonar das células T. Este protocolo apoia pesquisas translacionais sobre o homing pulmonar de células T e pode, assim, ajudar na identificação de novos alvos para uma terapia otimizada de doenças pulmonares inflamatórias ou alérgicas. Em particular, a capacidade de considerar a influência de propriedades de células imunes específicas da doença, organização de tecidos pulmonares e meio inflamatório na espirro pulmonar das células T torna este método altamente vantajoso.
No geral, nossa técnica é de alto valor para pesquisas imunológicas no campo de doenças pulmonares inflamatórias crônicas, que muitas vezes são impulsionadas por um acúmulo de tecido avassalador de células imunes ativadas. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato C57 preto 6J de pelo menos 16 gramas, de seis semanas de idade, anestoizado, use um micropipet para entregar lentamente 10 microliters de solução papain recém-preparada em uma narina do mouse uma vez por dia por três dias consecutivos. No dia seguinte à última administração do papain, a camada 10 mililitros de Ficoll médio sob sangue periférico humano de um voluntário saudável pré-diluído em uma proporção de um a dois na PBS para separação gradiente de densidade por centrifugação.
Transfira a célula sanguínea mononuclear periférica ou a camada de interfase PBMC em um novo tubo de 50 mililitros e colete as células por centrifugação. Em seguida, realize o isolamento de microesferas magnéticas de células positivas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante. Re-suspendendo as células T cd4 positivas isoladas em até uma vez dez vezes a sétima células T por pelo menos 500 microliters de concentração de PBS.
Rotule as células com um corante de proliferação celular de luz vermelha apropriada por 10 minutos a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, prendam a reação de rotulagem com cinco volumes de meio RPMI suplementados com 10% de FBS por cinco minutos no gelo seguidos por três lavagens em médio. Para transferência adotiva das células T positivas CD4 humanas em camundongos receptores expostos ao papain, suspender novamente as células T fluorescentes rotuladas para uma única vez 10 a sete células por concentração mililitro na PBS e carregar 100 microliters de células em uma seringa de um mililitro equipado com uma agulha de 30 bitola por animal receptor, em seguida, injetar todo o volume de células de uma seringa na veia traseira um animal tratado com papain mantendo a ponta da agulha dentro da veia para um adicional cinco segundos após a entrega da célula para evitar a descarga da suspensão da célula.
Três horas após a transferência de células adotivas, puna o ventrículo direito de cada rato eutanizado com uma cânula de 21 bitola conectada a um cateter e faça uma incisão no ventrículo esquerdo. Perfuse lentamente o pulmão com 20 mililitros de PBS gelado suplementado com 5 milimões EDTA seguido por dois mililitros de gelo 4%paraformaldeído. Quando todo o fixador tiver sido lavado através do tecido, remova as glândulas salivares e corte o músculo hioide severo para permitir que um fórceps seja deslizado sob a traqueia para expor o tecido do airtube.
Realize uma punção inicial da traqueia exposta com uma agulha de calibre 30 antes de substituir a agulha por um cateter de calibre 30 para evitar danos adicionais ao tecido. Use um suporte de agulha para selar a junção entre o cateter inserido e a traqueia, e encha cuidadosamente as vias aéreas com aproximadamente 37 graus Celsius 0,75% agarose até o completo desdobramento do pulmão. Uma junção apertada entre cateter e traqueia é fundamental para expandir o pulmão para seu tamanho fisiológico e manter a arquitetura tecidual para imagem.
Quando a agarose tiver se solidificado completamente, remova o cateter e transfira cuidadosamente o pulmão para um tubo escurecido de dois mililitros preenchido com 4%de desmase de 4%. Em seguida, desidratar o tecido com incubações sequenciais de etanol em rotação contínua a 31 rotações por minuto e quatro graus Celsius, conforme indicado por quatro horas por incubação. Após a desidratação completa, transfira a amostra para cinnamate etílico para uma incubação durante a noite à temperatura ambiente até que o tecido pareça translúcido.
Para uma microscopia fluorescente de folha de luz, use uma pequena gota de cola estável de solvente orgânico para grudar o pulmão no suporte amostral do microscópio e coloque o lobo pulmonar no suporte em posição vertical. Coloque o suporte de amostra em sua câmara e selecione os lasers apropriados para o experimento no software de instrumento. Em seguida, use os controles deslizantes sob óptica para definir uma largura de folha que abertura numérica que uniformemente revele todo o órgão ou uma seção específica de interesse.
Use o controle deslizante para definir a intensidade do laser sob controle de transmissão a laser para cada laser selecionado e clique em Aplicar. Use configurações avançadas de medição para mesclar as folhas de luz esquerda e direita para criar uma imagem iluminada de forma homogênea. Defina as posições de início e final da pilha Z a serem medidas sob o intervalo de varredura e defina o tamanho da etapa para cinco micrômetros e selecione autosave para salvar os arquivos automaticamente e inicie a medição para capturar as imagens.
Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, ative o botão 'Superar' no software de análise pós-imagem 3D e carregue a primeira imagem de uma pilha Z para iniciar a abertura e a reconstrução 3D automática de todas as outras imagens da pilha Z selecionada, em seguida, em Ajuste de Exibição, ajuste a intensidade, nível preto e contraste para cada canal. Para comparar o acúmulo de células humanas dentro do tecido pulmonar em diferentes amostras, selecione Editar e Crop 3D para definir um cubo pulmonar com um volume específico. Para quantificar as células rotuladas dentro do cubo pulmonar definido, abra Adicionar novos pontos na barra de ferramentas, clique em Pular a criação automática, editar manualmente e selecionar o canal de 640 nanômetros.
Defina a escala de raio para 10,00 mícrons, clique em Selecionar e em Editar, clique com o botão do mouse esquerdo para marcar individualmente cada célula fluorescente com um ponto. O número total de células contadas será exibido nas estatísticas. Para capturar uma imagem, use a ferramenta snapshot e ou use a ferramenta de animação para capturar um vídeo.
Enriquecimento celular baseado em microesferas e rotulagem subsequente de fluorescência como demonstrado normalmente resultam em uma pureza positiva cd4 de pelo menos 95% e uma rotulagem bem sucedida dessas células como determinada pela citometria de fluxo. A limpeza de tecido à base de cinnamate etílico atinge um alto nível de transparência do órgão indicando uma correspondência de índice refrativo bem-sucedida. O sinal auto-fluorescente do tecido pulmonar oferece uma ferramenta útil para visualizar a estrutura anatômica do pulmão por microscopia de folha de luz que pode ser exibida como uma projeção de intensidade média ou no modo de superfície.
Comparado com a microscopia convencional, a microscopia de folha de luz oferece a vantagem de toda a imagem de órgãos e posterior reconstrução 3D permitindo a identificação e visualização de células T de papelão-luz no contexto de todo o órgão, além disso, a preferência de células T humanas transferidas para acúmulo seletivo dentro do tecido pulmonar inflamado de animais expostos ao papain é ainda apoiada pelo fato de que as células T positivas do CD4 humano não podem ser recuperadas da mucosa intestinal dos animais receptores. Para a quantificação e comparação do acúmulo pulmonar de células T positivas CD4 humanas entre diferentes condições, as células rotuladas também podem ser contadas em vários cubos pulmonares de volume definido como demonstrado. A preparação cuidadosa do tecido, incluindo perfusão pulmonar, inflação e limpeza de tecidos é altamente importante para uma geração otimizada de imagens microscópicas de folha de luz de alta resolução.
Para confirmar ainda mais a diápedese bem sucedida dos linfócitos humanos transferidos, este protocolo pode ser facilmente combinado com a quantificação citométrica de fluxo de linfócitos humanos dentro da lavagem de broncoalveolar murina. A capacidade de monitorar células imunes derivadas de pacientes individuais em condições in vivo suporta a identificação de alterações funcionais em células imunes impressas por uma determinada doença ou terapia.
