La nostra tecnica consente l'imaging preciso delle cellule immunitarie umane accumulate dai polmoni in condizioni infiammatorie in vivo fornendo informazioni entusiasmanti sul processo di homing polmonare delle cellule T. Questo protocollo supporta la ricerca traslazionale sull'homing polmonare a cellule T e può quindi aiutare nell'identificazione di nuovi obiettivi per una terapia ottimizzata di malattie polmonari infiammatorie o allergiche. In particolare, la capacità di considerare l'influenza delle proprietà delle cellule immunitarie specifiche della malattia, dell'organizzazione del tessuto polmonare e dell'ambiente infiammatorio sull'homing polmonare delle cellule T rende questo metodo altamente vantaggioso.
Nel complesso, la nostra tecnica è di alto valore per la ricerca immunologica nel campo delle malattie polmonari infiammatorie croniche, che sono spesso guidate da un accumulo di tessuto travolgente di cellule immunitarie attivate. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi in un mouse C57 nero 6J di almeno 16 grammi, di sei settimane, usato un micropipetto per consegnare lentamente 10 microlitri di soluzione di papaina preparata al momento in una narice del mouse una volta al giorno per tre giorni consecutivi. Il giorno dopo l'ultima somministrazione di papaina, strato 10 millilitri di mezzo Ficoll sotto sangue periferico umano da un volontario sano pre-diluito ad un rapporto uno o due in PBS per la separazione del gradiente di densità per centrifugazione.
Trasferire la cellula ematica mononucleare periferica o lo strato interfase PBMC in un nuovo tubo da 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Successivamente, eseguire l'isolamento magnetico delle microperline di cellule positive CD4 secondo il protocollo del produttore. La sospensione delle cellule T positive CD4 isolate perline a un massimo di uno per dieci fino alla settima t cellule per almeno 500 microlitri di concentrazione di PBS.
Etichettare le cellule con un colorante di proliferazione cellulare eccitabile a luce rossa appropriato per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, arrestare la reazione di etichettatura con cinque volumi di mezzo RPMI integrati con 10%FBS per cinque minuti sul ghiaccio seguiti da tre lavaggi in mezzo. Per il trasferimento adottivo delle cellule T positive CD4 umane in topi riceventi esposti alla papaina, sospendere le cellule T etichettate fluorescentmente a una concentrazione di 1 per 10-settima per millilitro in PBS e caricare 100 microlitri di cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 30 calibro per animale ricevente, quindi iniettare l'intero volume di cellule da una siringa nella vena di coda un animale trattato con papaina mantenendo la punta dell'ago all'interno della vena per un ulteriore ago per un ulteriore cinque secondi dopo l'erogazione della cella per evitare lo scarico della sospensione cellulare.
Tre ore dopo il trasferimento cellulare adottivo, forare il ventricolo destro di ogni topo eutanasiato con una cannula calibro 21 collegata a un catetere e fare un'incisione nel ventricolo sinistro. Perfondere lentamente il polmone con 20 millilitri di PBS ghiacciato integrati con cinque EDTA millimolare seguiti da due millilitri di paraformaldeide ghiacciata al 4%. Quando tutto il fissatore è stato lavato attraverso il tessuto, rimuovere le ghiandole salivari e tagliare il muscolo ioide sternale per consentire a una forza di scivolare sotto la trachea per esporre il tessuto del flusso d'aria.
Eseguire una puntura iniziale della trachea esposta con un ago calibro 30 prima di sostituire l'ago con un catetere smussato calibro 30 per evitare ulteriori danni al tessuto. Utilizzare un portaaghi per sigillare la giunzione tra il catetere inserito e la trachea e riempire accuratamente le vie aeree con circa 37 gradi Celsius 0,75% di agarosio fino al completo svolgimento del polmone. Una stretta giunzione tra catetere e trachea è fondamentale per espandere il polmone alle sue dimensioni fisiologiche e mantenere l'architettura tissutale per l'imaging.
Quando l'agarosio si è completamente solidificato, rimuovere il catetere e trasferire con cura il polmone in un tubo oscurato da due millilitri riempito con 4%paraformaldehdye. Successivamente, disidratare il tessuto con incubazioni sequenziali di etanolo a rotazione continua a 31 rotazioni al minuto e quattro gradi Celsius come indicato per quattro ore per incubazione. Dopo la completa disidratazione, trasferire il campione in cinnamato etilico per un'incubazione notturna a temperatura ambiente fino a quando il tessuto appare traslucido.
Per una microscopia fluorescente a fogli leggeri, utilizzare una piccola goccia di colla stabile con solvente organico per attaccare il polmone al portacampioni del microscopio e impostare il lobo polmonare sul supporto in posizione verticale. Posizionare il portacampioni nella sua camera e selezionare i laser appropriati per l'esperimento nel software dello strumento. Quindi, usa i cursori sotto Ottica per impostare una larghezza del foglio che riveli uniformemente l'intero organo o una sezione specifica di interesse.
Utilizzare il dispositivo di scorrimento per impostare l'intensità del laser sotto il controllo della trasmissione laser per ogni laser selezionato e fare clic su Applica. Utilizzare le impostazioni di misurazione avanzate per unire i fogli luce sinistro e destro per creare un'immagine illuminata in modo omogeneo. Definire le posizioni iniziale e finale della pila Z da misurare nell'intervallo di scansione e impostare la dimensione del passo su cinque micrometri, quindi selezionare salvataggio automatico per salvare automaticamente i file e iniziare la misurazione per acquisire le immagini.
Una volta acquisite tutte le immagini, attivare il pulsante Supera nel software di analisi post-imaging 3D e caricare la prima immagine da una pila Z per avviare la ricostruzione 3D di apertura e automatica di tutte le altre immagini dello stack Z selezionato, quindi in Regolazione display, regolare l'intensità, il livello nero e il contrasto per ogni canale. Per confrontare l'accumulo di cellule umane all'interno del tessuto polmonare tra diversi campioni, selezionare Modifica e Ritaglia 3D per definire un cubo polmonare con un volume specifico. Per quantificare le celle etichettate all'interno del cubo polmonare definito, aprite Aggiungi nuove macchie sulla barra degli strumenti, fate clic su Salta creazione automatica (Skip automatic creation), modificate manualmente e selezionate il canale di 640 nanometri.
Impostare la scala del raggio su 10,00 micron, fare clic su Seleziona e in Modifica fare clic con il pulsante sinistro del mouse per contrassegnare singolarmente ogni cella fluorescente con un punto. Il numero complessivo di celle contate verrà visualizzato nelle statistiche. Per acquisire un'immagine, usa lo strumento snapshot e usa lo strumento di animazione per acquisire un video.
L'arricchimento cellulare a base di microperline e la successiva etichettatura a fluorescenza come dimostrato in genere si traducono in una purezza positiva del CD4 di almeno il 95% e in un'etichettatura riuscita di queste cellule come determinato dalla citometria del flusso. La compensazione dei tessuti a base di cinnamato etilico raggiunge un alto livello di trasparenza degli organi che indica una corretta corrispondenza dell'indice di rifrazione. Il segnale auto-fluorescente del tessuto polmonare offre uno strumento utile per immaginare la struttura anatomica del polmone mediante microscopia a fogli di luce che può essere visualizzata come proiezione di intensità media o in modalità superficie.
Rispetto alla microscopia convenzionale, la microscopia a fogli di luce offre il vantaggio dell'imaging di organi interi e della successiva ricostruzione 3D che consente l'identificazione e la visualizzazione di cellule T umane trasferite con colorante di proliferazione nel contesto dell'intero organo, inoltre, la preferenza delle cellule T umane trasferite per l'accumulo selettivo all'interno del tessuto polmonare infiammato degli animali esposti alla papaina è ulteriormente supportata dal fatto che le cellule T positive CD4 umane non possono essere recuperate dalla mucosa intestinale degli animali riceventi. Per la quantificazione e il confronto dell'accumulo polmonare di cellule T positive CD4 umane tra diverse condizioni, le cellule etichettate possono anche essere contate in diversi cubi polmonari di volume definito come dimostrato. Un'attenta preparazione dei tessuti, tra cui perfusione polmonare, gonfiaggio e compensazione dei tessuti, è molto importante per una generazione ottimizzata di immagini microscopiche a foglio luminoso ad alta risoluzione.
Per confermare ulteriormente la diapedesi riuscita dei linfociti umani trasferiti, questo protocollo può essere facilmente combinato con la quantificazione citometrica del flusso dei linfociti umani all'interno del lavaggio broncoalveolare murino. La capacità di monitorare le cellule immunitarie derivate da singoli pazienti in condizioni in vivo supporta l'identificazione di alterazioni funzionali nelle cellule immunitarie impresse da una particolare malattia o terapia.
