Tekniğimiz in vivo inflamatuar koşullarda akciğer birikmiş insan bağışıklık hücrelerinin kesin görüntüleme T hücre akciğer homing sürecine heyecan verici anlayışlar sağlayan sağlar. Bu protokol, T hücreli akciğer homing üzerine çeviri araştırmadestekler ve böylece inflamatuar veya alerjik akciğer hastalıklarının optimize edilmiş bir tedavi için yeni hedeflerin belirlenmesinde yardımcı olabilir. Özellikle hastalığa özgü immün hücre özellikleri, pulmoner doku organizasyonu ve inflamatuar ortamın T hücre liakciğer homing üzerindeki etkisini göz önünde bulundurma yeteneği bu yöntemi son derece avantajlı kAlmıştır.
Genel olarak, tekniğimiz kronik inflamatuar akciğer hastalıkları alanında immünolojik araştırma için yüksek değer, genellikle aktif bağışıklık hücrelerinin ezici bir doku birikimi tarafından tahrik edilir. En az 16 gram, altı haftalık, anestezik C57 siyah 6J fare de parmak sıkışma yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, yavaş yavaş farenin bir burun deliği içine taze hazırlanmış papain çözeltisi 10 mikrolitre teslim etmek için bir micropipet kullanın üç gün üst üste. Son papain uygulamasından bir gün sonra, insan periferik kanı altında 10 mililitre Ficoll ortamının tabakası, merkezleme ile yoğunluk gradyan ayrımı için PBS'de bir ya da iki oranında önceden seyreltilmiş sağlıklı bir gönüllüden elde edilir.
Periferik mononükleer kan hücresi veya PBMC interfaz tabakasını yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve santrifüj ile hücreleri toplayın. Daha sonra, üreticinin protokolüne göre CD4 pozitif hücrelerin manyetik mikrop izolasyon gerçekleştirin. Boncuk izole CD4 pozitif T hücrelerinin pbs konsantrasyonunun en az 500 mikrolitre başına yedinci T hücrelerinin bir katına kadar on katına kadar yeniden askıya alınması.
Hücreleri uygun bir kırmızı ışık uyarılabilir hücre çoğalması boyasıyla 37 santigrat derecede 10 dakika etiketleyin. Kuluçka sonunda, beş cilt RPMI orta ile beş ciltlik etiketleme reaksiyonunu %10 FBS ile buz üzerinde beş dakika boyunca durdurun ve ardından orta daki üç yıkAyım. İnsan CD4 pozitif T hücrelerinin papain maruz kalan alıcı farelere benimsenmesi için, floresan etiketli T hücrelerini PBS'deki mililitre konsantrasyonbaşına 10 kat 10'a kadar askıya alın ve 100 mikrolitre hücreyi alıcı hayvan başına 30 kalibrelik bir iğneyle donatılmış bir mililitrelik şırıngaya yükleyin, sonra bir şırıngadan kuyruk damarına tüm hücre hacmini enjekte edin. hücre süspansiyon taburcu önlemek için hücre tesliminden beş saniye sonra.
Kabul hücre transferinden üç saat sonra, her ötanazi li farenin sağ ventrikülünü bir katetere bağlı 21 kalibrelik kanülle delin ve sol ventrikülde bir kesi yapın. Yavaş yavaş beş milimolar EDTA ile takviye buz gibi PBS 20 mililitre ile akciğer perfuse buz gibi iki mililitre 4% paraformaldehit. Tüm fiksatif doku yoluyla temizlenmiş zaman, tükürük bezleri kaldırmak ve bir forceps hava tüpü dokusu ortaya çıkarmak için trakea altında kaydırılmış izin sternal hyoid kas kesti.
Dokuda daha fazla hasar oluşmasını önlemek için iğneyi künt 30 kalibrelik bir kateterle değiştirmeden önce 30 kalibrelik bir iğneyle maruz kalan trakeanın ilk delinmesini gerçekleştirin. Yerleştirilen kateter ve trakea arasındaki kavşağı mühürlemek için bir iğne tutucu kullanın ve akciğer tamamen açılıncaya kadar hava yollarını yaklaşık 37 santigrat derece %0,75 agarose ile dikkatlice doldurun. Kateter ve trakea arasında sıkı bir kavşak, akciğerin fizyolojik boyutuna genişlemesi ve görüntüleme için doku mimarisinin korunması açısından kritik öneme sahiptir.
Agarose tamamen katılaşmış olduğunda, kateteri çıkarın ve dikkatlice% 4 paraformaldehdye ile dolu karanlık, iki mililitrelik tüp içine akciğer aktarın. Daha sonra, dakikada 31 rotasyon ve kuluçka başına dört saat boyunca belirtildiği gibi dört santigrat derece sürekli rotasyon altında sıralı etanol kuluçka ile doku dehydrate. Tam dehidratasyondan sonra, doku yarı saydam görünene kadar oda sıcaklığında bir gecede kuluçka için eti cinnamate içine örnek aktarın.
Hafif bir floresan mikroskopi için, akciğeri mikroskopun numune tutucuya yapıştırmak ve akciğer lobunu düpedüz bir pozisyonda tutucuya ayarlamak için küçük bir damla organik çözücü kararlı tutkal kullanın. Numune tutucuyu odasına yerleştirin ve deney için uygun lazerleri cihaz yazılımında seçin. Daha sonra, optik altında kaydırıcıları kullanarak tüm organı veya belirli bir ilgi bölümünü düzgün bir şekilde ortaya getiren sayısal diyafram açıklığını belirleyen bir sayfa genişliği ayarlayın.
Seçilen her lazer için lazer iletim kontrolü altında lazer yoğunluğunu ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın ve Uygula'yı tıklatın. Homojen bir şekilde aydınlatılmış görüntü oluşturmak için sol ve sağ ışık yapraklarını birleştirmek için Gelişmiş ölçüm ayarlarını kullanın. Z yığınının başlangıç ve bitiş konumlarını tarayın aralığı altında ölçülecek şekilde tanımlayın ve adım boyutunu beş mikrometreye ayarlayın ve ardından dosyaları otomatik olarak kaydetmek için otomatik kaydetme'yi seçin ve görüntüleri yakalamak için ölçümü başlatın.
Tüm görüntüler elde edildiğinde, 3B görüntüleme sonrası analiz yazılımındaki Aşma düğmesini etkinleştirin ve seçilen Z yığınının diğer tüm görüntülerinin açılışını ve otomatik 3D rekonstrüksiyonunu başlatmak için ilk görüntüyü bir Z yığınından yükleyin, ardından Ekran Ayarlaması altında, her kanal için yoğunluğu, siyah düzeyi ve kontrastı ayarlayın. Farklı örnekler arasında pulmoner doku içinde insan hücrelerinin birikimini karşılaştırmak için, belirli bir hacim ile bir akciğer küpü tanımlamak için Edit ve Kırpma 3D seçin. Tanımlanan akciğer küpündeki etiketli hücreleri ölçmek için araç çubuğuna Yeni Noktalar Ekle'yi açın, otomatik oluşturmayı atla'yı tıklatın, el ile düzenle'yi tıklatın ve 640 nanometre kanalını seçin.
Yarıçap ölçeğini 10,00 mikron olarak ayarlayın, Seç'i tıklatın ve Edit'in altında, her floresan hücreyi bir noktayla tek tek işaretlemek için sol fare düğmesiyle Shift tuşuna basın. Sayılan hücrelerin toplam sayısı istatistiklerde görüntülenir. Bir görüntüyü yakalamak için anlık görüntü aracını kullanın ve bir video çekmek için animasyon aracını kullanın.
Mikrobead bazlı hücre zenginleştirme ve daha sonra floresan etiketleme tipik olarak en az% 95 bir CD4 pozitif saflık ve akış sitometri tarafından belirlenen bu hücrelerin başarılı bir etiketleme neden gösterir. Etil cinnamate bazlı doku temizleme başarılı bir kırılma indeksi eşleştirme gösteren organ şeffaflık yüksek düzeyde elde eder. Akciğer dokusunun otofloresan sinyali, ortalama yoğunluk projeksiyonu olarak veya yüzey modunda görüntülenebilen ışık sayfası mikroskobu ile akciğerin anatomik yapısını görüntülemek için yararlı bir araç sunar.
Konvansiyonel mikroskopi ile karşılaştırıldığında, ışık sayfası mikroskopi tüm organ görüntüleme ve daha sonra 3D rekonstrüksiyonu, proliferasyon boya etiketli, aktarılan insan T hücrelerinin tüm organ bağlamında tanımlanması ve görselleştirilmesi sağlayan avantajı sunuyor, ayrıca, papain maruz hayvanların iltihaplı akciğer dokusu içinde seçici birikimi için transfer insan T hücrelerinin tercihi insan CD4 pozitif T hücreleri hayvanların bağırsak alıcı dan elde edilemez gerçeği ile daha da desteklenir. Farklı koşullar arasında insan CD4 pozitif T hücrelerinin pulmoner birikiminin nicelleştirilmesi ve karşılaştırılması için, etiketli hücreler de gösterildiği gibi tanımlanan hacmin çeşitli akciğer küpleri sayılabilir. Akciğer perfüzyonu, şişirme ve doku temizleme gibi dikkatli doku hazırlama, yüksek çözünürlüklü ışık sayfası mikroskobik görüntülerin optimize edilmiş üretimi için son derece önemlidir.
Aktarılan insan lenfositlerinin başarılı diyadiklerini doğrulamak için, bu protokol kolayca minrik bronkoalveoler lavaj içinde insan lenfositlerin akış sitometrik nicelik ile kombine edilebilir. In vivo koşullarda bireysel hastalardan elde edilen bağışıklık hücrelerini izlemek için yeteneği belirli bir hastalık veya tedavi tarafından baskılı bağışıklık hücrelerinde fonksiyonel değişikliklerin belirlenmesini destekler.
