미토콘드리아 기능은 세포 항상성에 중요하며 산소 소비율은 미토콘드리아 건강의 결정적인 지표입니다. 이 프로토콜은 C.elegans의 산소 소비속도를 분석하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능의 법적 측정을 제공하는 라이브, 모바일 C.elegans를 사용합니다.
미토콘드리아를 분리할 필요성을 높이는 것은 무결성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 단계입니다. 시작하려면, 선충 성장 매체 또는 NGM 플레이트에 에샤리치아 대장균의 갓 씨를 뿌린 잔디밭에 원하는 유전 배경의 L4 애벌레를 전송합니다. 각 변형에 대해 적어도 두 개의 100mm 또는 3 개의 60mm 플레이트를 사용하십시오.
3~4일 동안 적절한 성장 온도에서 벌레를 배양하거나, 판이 많은 수의 계란과 중력 벌레로 농축될 때까지 배양합니다. 선충의 100밀리미터 플레이트 당 약 6 밀리리터의 M9 버퍼를 사용하여 계란과 벌레를 접시에서 씻어냅니다. 유리 목초지 파이펫을 사용하여 계란과 벌레를 각 변형에 대해 개별 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다.
6, 180g에서 3 분 동안 체튜브를 아래로 회전시하십시오. 원심 분리에 따라, M9 버퍼만 동물과 계란 펠릿을 유지 밖으로 흡인. 각 튜브에 3~4밀리리터의 표백제 용액을 넣고 간헐적으로 소용돌이를 6분간 추가합니다.
그런 다음 M9 버퍼를 추가하여 각 튜브를 채우고 1 분 동안 6, 180g에서 회전합니다. 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 M9로 이 세척을 세 번 반복합니다. 세척 후, 계란 펠릿을 M9 버퍼의 약 9 밀리리터를 포함하는 신선한 15 밀리리터 튜브로 이동합니다.
16~48시간 동안 섭씨 20도에 누디징하여 갓 부화한 벌레를 동기화합니다. 이 튜브를 6, 180g에서 1.5분 동안 아래로 회전한 후 동기화된 L-1 동물을 개별 NGM 플레이트에 OP50의 갓 시드잔디에 놓습니다. 동물이 약 42 시간 후에 L-4 애벌레 단계에 도달 할 때까지 접시를 섭씨 20도에서 유지하십시오.
이때, 플래티넘 픽을 사용하여 L4 애벌레를 OP50 시드 NGM 플레이트로 이동하여 FUdR의 밀리리터당 0.5 밀리그램을 함유하여 자손 생성을 방지합니다. 플레이트의 각 우물에 증류수 200 마이크로리터를 추가하여 센서 카트리지에 수분을 공급하여 센서 프로브가 침수되도록 합니다. 접시를 실온에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
호흡로메터 인터페이스 내에서 가열 요소를 끕니다. 기계를 섭씨 15도 안에 보관하면 기계 내의 핵심 온도가 낮아지고 분석 중에 동물이 과열되는 것을 방지합니다. 하룻밤 동안 배양 한 후, 파이프 아웃 및 센서 프로브를 수화하는 데 사용되는 증류수를 폐기하고 각 우물에서 교정 용액의 200 마이크로 리터로 교체하십시오.
FCCP 스톡 솔루션을 증류수에 100 마이크로몰러 FCCP로 희석합니다. 그런 다음 센서 카트리지에 주입 포트 A에 희석 된 용액의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 센서 카트리지의 주입 포트 B에 400 밀리머 나트륨 아지드22 마이크로리터를 추가합니다.
이제 호흡을 켜십시오. 홈 화면에서 시작 을 선택하고 템플릿 페이지가 나타납니다. 템플릿 페이지에서 빈"또는 이전에 디자인된 템플릿을 선택합니다.
그룹 페이지가 나타납니다. 그룹 페이지에서 우물 A와 H를 배경 우물로 선택하고 실험 계획에 따라 나머지 6개의 우물을 적절한 그룹으로 할당합니다. 오른쪽 아래의 화살표를 클릭하여 프로토콜 페이지에 액세스하고 평형, 기초 및 주사 하나 및 두 개의 버튼이 선택되었는지 확인합니다.
기초 OCR의 판독값 수와 최대 OCR 및 비 미토콘드리아 OCR의 판독 값을 조정합니다. 오른쪽 아래 모서리에 있는 화살표를 선택합니다. 센서 카트리지 플레이트를 로드하라는 메시지가 나타납니다.
미리 알림 프롬프트 화면의 지침에 따라 센서 카트리지 플레이트가 올바른 방향으로 로드되었는지 확인합니다. 호흡보호계는 이제 카트리지를 평형화합니다. 200 마이크로리터의 M9 버퍼를 8개의 우물과 세포판 주변 저수지에 넣습니다.
각 변형에서 약 100개의 웜을 시드되지 않은 NGM 플레이트에 선택하고 2~3분 동안 휴식을 취하십시오. 그런 다음, M9 버퍼로 백금 픽의 끝을 적시고 20 나이 동기화 된 동물을 G를 통해 우물 B로 선택하여 배경 우물 A와 H가 비어 있습니다. 이제 respirometer 소프트웨어에서 확인을 클릭하여 교정 버퍼가 포함된 플레이트를 배출합니다.
센서 카트리지를 기기 내부에 두고 호흡로메터에서 플레이트를 제거합니다. 교정판을 동물을 포함하는 접시로 교체합니다. 플레이트를 적재하고 계속 타격하여 문을 닫고 분석이 실행되도록 합니다.
분석 실행이 완료되면 화면의 프롬프트를 따라 셀 플레이트와 센서 카트리지를 제거합니다. 실행 데이터 전쟁 형식을 저장하려면 USB 포트에 플래시 드라이브를 삽입합니다. 센서 카트리지를 제거하고 동물이 약 2 분 동안 우물 바닥에 정착 할 수 있도록합니다.
세포판을 스테레오 해부 현미경 아래에 놓고 우물당 동물의 수를 계산합니다. 분석 소프트웨어를 열고 정규화 탭을 통해 산소 소비율을 동물 수로 정상화합니다. 수정"탭 의 다양한 그룹에 적합한 수준을 적용하고 추가 분석을 위해 프리즘 파일로 파일을 내보냅니다.
처음 다섯 측정의 평균은 기저 OCR입니다. FCCP 추가 후 5가지 측정값의 평균은 최대 OCR입니다. 마지막으로, 나트륨 아지드 첨가 후 마지막 5가지 측정의 평균은 미토콘드리아 호흡률이 아니다.
칼슘 dysregulation변경된 미토콘드리아 기능을 초래할 수 있기 때문에, 셀-12 돌연변이및 야생형 동물 모두에서 OCR은 미토콘드리아 기능 및 건강에 대한 셀-12 돌연변이의 효과를 검사하기 위해 측정하였다. 야생 형 동물은 지속적으로 웜 당 분당 5 피코몰 보다 기저 OCR 비율을 보였다. 셀-12 돌연변이의 세 가지 변종은 모두 상당히 상승 된 OCR을 보였지만, 분당 약 7 개의 피코몰이 웜 당 나타났습니다.
FCCP가 추가되면 예상대로 야생 유형의 OCR뿐만 아니라 셀-12 돌연변이가 증가했습니다. 야생 형 동물은 벌레 당 분당 약 7 개의 피코몰의 최대 OCR을 보였습니다. 셀-12 돌연변이는 분당 약 10 개의 피코몰을 가지고 있었지만 웜 당.
이 분석에서 라이브, 잘 먹이고 비동기 동물을 사용하고 계란이나 시체를 분석 우물로 옮기는 것을 피하십시오. 또한, 기기의 내부 온도는 섭씨 25도를 초과해서는 안됩니다. 표백제, FCCP, FUdR 및 아지드 나트륨은 독성이 있습니다.
따라서 재고 솔루션 및 약물 적재 를 준비하는 동안 보호 장갑을 착용해야합니다.
