Mitochondriale Funktion ist entscheidend für die zelluläre Homöostase und Sauerstoffverbrauch Rate ist ein entscheidender Indikator für mitochondriale Gesundheit. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate in C.elegans. Dieses Protokoll nutzt livee, mobile C.elegans, die eine rechtliche Messung der mitochondrialen Funktion bieten.
Erhöhung der Notwendigkeit, Mitochondrien zu isolieren, ein Schritt, der potenziell seine Integrität beeinträchtigen könnte. Um zu beginnen, übertragen L4 Larven der gewünschten genetischen Hintergründe auf einen frisch gesäten Rasen von Escherichia coli auf Nematoden-Wachstumsmedien oder NGM-Platten. Verwenden Sie mindestens zwei 100 mm oder drei 60 mm Platten für jede Dehnung.
Die Würmer drei bis vier Tage lang bei der entsprechenden Wachstumstemperatur bebrüten, oder bis die Platten mit einer großen Anzahl von Eiern und Gravidwürmern konzentriert sind. Waschen Sie die Eier und Würmer von den Tellern mit etwa 6 Milliliter M9 Puffer pro 100 Millimeter Platte Nematoden. Mit Glasweidenpipetten die Eier und Würmer in einzelne 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen für jeden Stamm übertragen.
Spin Thesen Röhren nach unten für drei Minuten bei 6, 180 g. Nach der Zentrifugation, aspirieren Sie den M9-Puffer, der nur das Tier und Eipellet behält. Fügen Sie drei bis vier Milliliter Bleichlösung zu jedem Rohr und intermittierend Wirbel für sechs Minuten.
Fügen Sie dann den M9-Puffer hinzu, um jedes Rohr zu füllen, und drehen Sie es eine Minute lang bei 6, 180 g. Den Überstand ansaugen und diese Wäsche dreimal mit dem M9 wiederholen. Nach dem Waschen das Eipellet in ein frisches 15-Milliliter-Rohr mit etwa neun MilliliterM9-Puffer bewegen.
Synchronisieren Sie die frisch geschlüpften Würmer, indem Sie 16 bis 48 Stunden bei 20 Grad Celsius nisieren. Nachdem Sie diese Rohre 1,5 Minuten lang bei 6, 180 g nach unten gesponnen haben, legen Sie die synchronisierten L-1-Tiere auf einen frisch gesäten Rasen von OP50 auf einzelnen NGM-Platten. Halten Sie die Platten bei 20 Grad Celsius, bis die Tiere nach ca. 42 Stunden das L-4 Larvenstadium erreichen.
Zu diesem Zeitpunkt verwenden Sie einen Platin-Pick, um die L4-Larven auf OP50-gesäte NGM-Platten mit 0,5 Milligramm pro Milliliter FUdR zu bewegen, um die Produktion von Nachkommen zu verhindern. Hydratisieren Sie die Sensorpatrone, indem Sie jedem Brunnen auf der Platte 200 Mikroliter destilliertes Wasser hinzufügen, um sicherzustellen, dass die Sensorsonden untergetaucht sind. Lagern Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur.
Schalten Sie das Heizelement innerhalb der Respirometer-Schnittstelle aus. Die Lagerung der Maschine in einem 15 Grad Celsius Inkubator senkt die Kerntemperatur innerhalb der Maschine und verhindert, dass die Tiere während des Assays überhitzen. Nach der nächtlichen Inkubation das destillierte Wasser, das zur Hydratisierung der Sensorsonden verwendet wird, ausderapipetten und entsorgen und in jedem Brunnen durch 200 Mikroliter der Kalibrantlösung ersetzen.
Verdünnen Sie die FCCP-Lagerlösung auf 100 Mikromolar FCCP in destilliertem Wasser. Fügen Sie dann 20 Mikroliter der verdünnten Lösung in den Injektionsanschluss A in die Sensorpatrone ein. Fügen Sie 22 Mikroliter 400 Millimolar-Natriumaziden zum Injektionsanschluss B der Sensorpatrone hinzu.
Schalten Sie nun das Respirometer ein. Wählen Sie auf dem Startbildschirm Start aus, und die Vorlagenseiten werden angezeigt. Wählen Sie auf der Vorlagenseite "blank" oder eine zuvor entworfene Vorlage aus.
Die Gruppenseite wird angezeigt. Wählen Sie auf der Gruppenseite die Bohrungen A und H als Hintergrundbrunnen aus und ordnen die restlichen sechs Brunnen entsprechend dem Versuchsplan entsprechenden Gruppen zu. Greifen Sie auf die Protokollseite zu, indem Sie auf den Pfeil unten rechts klicken, und stellen Sie sicher, dass die Schaltflächen "Gleichgewicht", "Basal" und "Injektionen" eins und zwei ausgewählt sind.
Passen Sie die Anzahl der Messwerte von Basal-OCR sowie maximale OCR und nicht-mitochondriale OCR an. Wählen Sie den Pfeil in der unteren rechten Ecke aus. Es wird eine Aufforderung zum Laden der Sensorpatronenplatte angezeigt.
Stellen Sie sicher, dass die Sensorkassetteinplatte in der richtigen Ausrichtung geladen ist, und folgen Sie den Anweisungen auf dem Mahnaufforderungsbildschirm. Das Respirameter gleicht nun die Patrone aus. Fügen Sie 200 Mikroliter M9-Puffer in jeden der acht Brunnen und umgebenden Reservoirs der Zellplatte hinzu.
Wählen Sie etwa 100 Würmer von jeder Sorte auf ungesättigte NGM-Platten und lassen Sie sie für zwei bis drei Minuten ruhen. Dann das Ende des Platin-Pickmitals mit M9-Puffer nass machen und 20 alterssynchronisierte Tiere in Brunnen B bis G pflücken, wobei die Hintergrundbrunnen A und H leer bleiben. Klicken Sie nun auf OK in der Respirometer-Software, um die Platte mit dem Kalibrierpuffer auszuwerfen.
Entfernen Sie die Platte aus dem Respirometer und lassen Sie die Sensorpatrone im Gerät zurück. Ersetzen Sie die Kalibrierplatte durch die Platte, die die Tiere enthält. Laden Sie Platten und schließen Sie die Tür durch Drücken weiter und lassen Sie den Test laufen.
Sobald der Testlauf abgeschlossen ist, folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Zellplatte und die Sensorpatrone zu entfernen. Legen Sie ein Flash-Laufwerk in den USB-Anschluss ein, um das Run Data War-Format zu speichern. Entfernen Sie die Sensorpatrone und lassen Sie die Tiere für etwa zwei Minuten an der Unterseite der Brunnen absetzen.
Legen Sie die Zellplatten unter ein Stereo-Sezieren-Mikroskop und zählen Sie die Anzahl der Tiere pro Brunnen. Öffnen Sie die Analysesoftware, gefolgt von der Registerkarte Normalisierung, um die Sauerstoffverbrauchsraten auf die Anzahl der Tiere zu normalisieren. Wenden Sie die entsprechenden Ebenen für die verschiedenen Gruppen unter der Registerkarte "Ändern" an, und exportieren Sie die Datei als Prismadatei zur weiteren Analyse.
Der Durchschnitt der ersten fünf Messungen ist der basale OCR. Der Durchschnitt der fünf Messungen nach FCCP-Zugabe ist der maximale OCR. Schließlich ist der Durchschnitt der letzten fünf Messungen nach Natriumazidzugabe die nicht-mitochondriale Atmungsrate.
Da die Kalziumdysregulation zu einer veränderten mitochondrialen Funktion führen kann, wurden OCR sowohl bei den Sel-12-Mutanten als auch bei Wildtieren gemessen, um die Wirkung von Sel-12-Mutationen auf die mitochondriale Funktion und Gesundheit zu untersuchen. Wildtiere zeigten durchweg basale OCR-Raten unter fünf Picomolen pro Minute und Wurm. Während alle drei Stämme von Sel-12-Mutanten signifikant erhöhte OCR zeigten, von etwa sieben Picomolen pro Minute, pro Wurm.
Nach der Zugabe von FCCP gab es eine Zunahme der OCR von wildartigem Typ, sowie sel-12 Mutanten, wie erwartet. Wildtiere wiesen eine maximale OCR von etwa sieben Picomolen pro Minute und Wurm auf. Während sel-12 Mutanten OCR von etwa 10 Picomole pro Minute, pro Wurm hatten.
Verwenden Sie lebende, gut gefütterte und synchronisierte Tiere in diesem Test, und vermeiden Sie die Übertragung von Eiern oder Kadaver nasiniert. Darüber hinaus sollte die Innentemperatur des Instruments 25 Grad Celsius nicht überschreiten. Bleichmittel, FCCP, FUdR und Natriumazid sind giftig.
Daher sollte darauf geachtet werden, Schutzhandschuhe bei der Vorbereitung von Lagerlösungen und der Drogenbeladung zu tragen.
