La fonction mitochondriale est essentielle à l’homéostasie cellulaire et le taux de consommation d’oxygène est un indicateur décisif de la santé mitochondriale. Ce protocole fournit des instructions détaillées pour analyser le taux de consommation d’oxygène dans C.elegans. Ce protocole utilise des C.elegans mobiles vivants fournissant une mesure légale de la fonction mitochondriale.
Élever la nécessité d’isoler les mitochondries, une étape qui pourrait potentiellement avoir un effet sur son intégrité. Pour commencer, transférez les larves L4 des milieux génétiques désirés sur une pelouse fraîchement ensemencée d’Escherichia coli sur des supports de croissance de nématode ou des plaques de NGM. Utilisez au moins deux plaques de 100 mm ou trois plaques de 60 mm pour chaque souche.
Incuber les vers à la température de croissance appropriée pendant trois à quatre jours, ou jusqu’à ce que les plaques soient concentrées avec un grand nombre d’œufs et de vers gravids. Lavez les œufs et les vers des plaques à l’aide d’environ 6 millilitres de tampon M9 par plaque de nématodes de 100 millimètres. À l’aide de pipettes de pâturage en verre, transférer les œufs et les vers dans des tubes de centrifugeuse individuels de 15 millilitres pour chaque souche.
Faites tourner ces tubes vers le bas pendant trois minutes à 6, 180 g. Après centrifugation, aspirez le tampon M9 en conservant seulement l’animal et la pastille d’oeuf. Ajouter trois à quatre millilitres de solution d’eau de Javel à chaque tube et vortex par intermittence pendant six minutes.
Ajouter ensuite le tampon M9 pour remplir chaque tube et tourner à 6 180 g pendant une minute. Aspirer le supernatant et répéter ce lavage avec le M9, trois fois. Après le lavage, déplacez la pastille d’œuf dans un tube frais de 15 millilitres contenant environ neuf millilitres de tampon M9.
Synchronisez les vers fraîchement éclos en les nutant à 20 degrés Celsius pendant 16 à 48 heures. Après avoir fait tourner ces tubes à 6 180 g pendant 1,5 minute, ez les animaux synchronisés L-1 sur une pelouse fraîchement ensemencée d’OP50 sur des plaques NGM individuelles. Gardez les plaques à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les animaux atteignent le stade larvaire L-4 après environ 42 heures.
À l’heure actuelle, utilisez une pioche au platine pour déplacer les larves de L4 vers des plaques de MNM ensemencées OP50 contenant 0,5 milligramme par millilitre de FUdR pour empêcher la progéniture de produire. Hydratez la cartouche du capteur en ajoutant 200 microlitres d’eau distillée à chaque puits de la plaque, en veillant à ce que les sondes du capteur soient submergées. Conserver les assiettes toute la nuit à température ambiante.
Éteignez l’élément chauffant à l’intérieur de l’interface du respiromètre. Le stockage de la machine à l’intérieur d’un incubateur de 15 degrés Celsius abaisse la température centrale à l’intérieur de la machine et empêche les animaux de surchauffer pendant l’essai. Après l’incubation pendant la nuit, pipette et jeter l’eau distillée utilisée pour hydrater les sondes capteur, et le remplacer par 200 microlitres de la solution calibrant dans chaque puits.
Diluer la solution de stock FCCP à 100 micromolar FCCP dans de l’eau distillée. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution diluée au port d’injection A dans la cartouche du capteur. Ajouter 22 microlitres d’azides de sodium de 400 millimlaires au port d’injection B de la cartouche du capteur.
Maintenant, allumez le respiromètre. Sur l’écran d’accueil, sélectionnez démarrer et les pages de modèle s’afficheront. Sur la page des modèles, sélectionnez blank » ou un modèle précédemment conçu.
La page groupes s’affiche. Sur la page groupes, sélectionnez les puits A et H comme puits d’arrière-plan et assignez les six puits restants en groupes appropriés selon le plan expérimental. Accédez à la page du protocole en cliquant sur la flèche en bas à droite, et assurez-vous que l’équilibre, basal et injections un et deux boutons sont sélectionnés.
Ajustez le nombre de lectures de l’OCR basal ainsi que l’OCR maximum et l’OCR non mitochondrial. Sélectionnez la flèche dans le coin inférieur droit. Une invite à charger la plaque de cartouche du capteur apparaîtra.
Assurez-vous que la plaque de cartouche du capteur est chargée dans la bonne orientation, en suivant les instructions sur l’écran d’invite de rappel. Le respirameter va maintenant équilibrer la cartouche. Ajouter 200 microlitres de tampon M9 dans chacun des huit puits et réservoirs environnants de la plaque cellulaire.
Cueillez environ 100 vers de chaque souche sur des plaques de NGM non enseillées et laissez reposer pendant deux à trois minutes. Ensuite, mouillez l’extrémité de la pioche platine avec le tampon M9 et choisissez des animaux synchronisés de 20 âges dans les puits B à G, laissant les puits de fond A et H vides. Maintenant, cliquez sur OK sur le logiciel de respiromètre pour éjecter la plaque contenant tampon d’étalonnage.
Retirez la plaque du respiromètre en laissant la cartouche du capteur à l’intérieur de l’instrument. Remplacer la plaque calibrée par la plaque contenant les animaux. Chargez les plaques et fermez la porte en frappant continuer et permettre à l’essai de courir.
Une fois l’analyse terminée, suivez les invites sur l’écran pour enlever la plaque cellulaire et la cartouche du capteur. Insérez un lecteur flash dans le port USB pour enregistrer le format de guerre des données en cours d’exécuter. Retirez la cartouche du capteur et laissez les animaux s’installer au fond des puits pendant environ deux minutes.
Placez les plaques cellulaires sous un microscope à disséquer stéréo et comptez le nombre d’animaux par puits. Ouvrez le logiciel d’analyse, suivi de l’onglet normalisation, pour normaliser les taux de consommation d’oxygène au nombre d’animaux. Appliquez les niveaux appropriés pour les différents groupes sous l’onglet modifier et exportez le fichier sous forme de fichier prisme pour une analyse plus approfondie.
La moyenne des cinq premières mesures est l’OCR basal. La moyenne des cinq mesures après l’ajout de FCCP est l’OCR maximal. Enfin, la moyenne des cinq dernières mesures après l’ajout d’azide de sodium est le taux de respiration non mitochondriale.
Puisque la dysrégulation de calcium peut avoir comme conséquence la fonction mitochondrique altérée, ocr dans les mutants sel-12 et les animaux sauvages de type ont été mesurés pour examiner l’effet des mutations sel-12 sur la fonction mitochondrique et la santé. Les animaux de type sauvage présentaient constamment des taux basaux d’OCR inférieurs à cinq picomoles par minute, par ver. Tandis que les trois souches des mutants sel-12 ont montré l’OCR sensiblement élevé, d’approximativement sept picomoles par minute, par ver.
Lors de l’ajout de FCCP, il y avait une augmentation de l’OCR de type sauvage, ainsi que sel-12 mutants, comme prévu. Les animaux de type sauvage présentaient un taux maximum d’OCR d’environ sept picomoles par minute, par ver. Tandis que les mutants sel-12 ont eu ocr d’approximativement 10 picomoles par minute, par ver.
Utilisez des animaux vivants, bien nourris et asynchronisés dans cet essai, et évitez le transfert d’œufs ou de carcasses dans des puits d’analyse. De plus, la température interne de l’instrument ne doit pas dépasser 25 degrés Celsius. L’eau de Javel, le FCCP, le FUdR et l’azide de sodium sont toxiques.
Par conséquent, il faut prendre soin de porter des gants de protection pendant la préparation des solutions de stock et le chargement des médicaments.
