Mitokondriyal fonksiyon hücresel homeostaz için önemlidir ve oksijen tüketim hızı mitokondriyal sağlığın belirleyici bir göstergesidir. Bu protokol, C.elegans'taki oksijen tüketim oranının analizine yönelik ayrıntılı talimatlar vermektedir. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonun yasal bir ölçümünü sağlayan canlı, mobil C.elegans'tan yararlanıyor.
Mitokondriyi izole etme ihtiyacını arttırmak, bütünlüğü etkileyebilecek bir adım. Başlamak için, nematod büyüme medya veya NGM plakaları üzerinde Escherichia coli taze tohumlu çim üzerine istenilen genetik arka planlar L4 larvaları aktarın. Her suşu için en az iki adet 100 mm veya üç adet 60 mm plaka kullanın.
Solucanları uygun büyüme sıcaklığında üç ila dört gün veya plakalar çok sayıda yumurta ve gravid solucanla yoğunlaşana kadar kuluçkaya yatırın. Yumurtaları ve solucanları 100 milimetrelik nematod tabakası başına yaklaşık 6 mililitre M9 tamponu kullanarak plakalardan yıkayın. Cam mera pipetleri kullanarak, her suşu için ayrı 15 mililitrelik santrifüj tüpler içine yumurta ve solucanlar aktarın.
6, 180 g üç dakika boyunca aşağı tez tüpleri spin. Santrifüjden sonra, M9 tamponunu aspire edin ve sadece hayvan ve yumurta peletini koruyun. Her tüp ve aralıklı girdap altı dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisi üç ila dört mililitre ekleyin.
Sonra, her tüp doldurmak ve bir dakika için 6, 180 g spin M9 tampon ekleyin. Supernatant aspirate ve M9 ile bu yıkama tekrarlayın, üç kez. Yıkamadan sonra, yumurta peletini yaklaşık dokuz mililitre M9 tamponu içeren 15 mililitrelik taze bir tüpe taşıyın.
Yeni yumurtadan çıkan solucanları 20 derecede 16 ila 48 saat boyunca somunlayarak senkronize edin. Bu tüpleri 6, 180 g'da 1,5 dakika eğdikten sonra, senkronize Edilmiş L-1 hayvanlarını tek tek NGM plakaları üzerinde yeni tohumlanmış OP50 çimlerine yerleştirin. Hayvanlar yaklaşık 42 saat sonra L-4 larva aşamasına ulaşana kadar plakaları 20 derecede tutun.
Şu anda, L4 larvalarını mililitre başına 0,5 miligram FUdR içeren OP50 tohumlu NGM plakalarına taşımak için platin bir kazma kullanın. Sensör kartuşunu plakadaki her kuyuya 200 mikrolitre distile su ekleyerek nemlendirin ve sensör problarının batırılmasını sağlar. Tabakları gece boyunca oda sıcaklığında saklayın.
Solunum arayüzündeki ısıtma elemanını kapatın. Makinenin 15 derecelik bir kuluçka makinesi içinde saklanması, makineiçindeki çekirdek sıcaklığını düşürür ve titre sırasında hayvanların aşırı ısınmasını önler. Bir gece kuluçkadan sonra, pipet dışarı ve sensör probları nemlendirmek için kullanılan distile su atmak ve her kuyuda kalibrant çözeltisi 200 mikrolitre ile değiştirin.
FCCP stok çözeltisini distile suda 100 mikromolar FCCP'ye seyreltin. Ardından, sensör kartuşundaki enjeksiyon portu A'ya seyreltilmiş çözeltinin 20 mikrolitresini ekleyin. Sensör kartuşunun b enjeksiyon portuna 22 mikrolitre 400 milimolar sodyum azit ekleyin.
Şimdi, solunum cihazını aç. Ana ekranda başlat'ı seçin ve şablon sayfaları görüntülenir. Şablonlar sayfasında boş"u veya önceden tasarlanmış bir şablonu seçin.
Gruplar sayfası görüntülenir. Gruplar sayfasında, arka plan kuyuları olarak A ve H kuyularını seçin ve kalan altı kuyuyu deney planına göre uygun gruplara atayın. Sağ alttaki oku tıklatarak protokol sayfasına erişin ve bir ve iki düğmenin seçildiğinden emin olun.
Bazal OCR okumalarının yanı sıra maksimum OCR ve mitokondriyal olmayan OCR okuma sayısını ayarlayın. Sağ alt köşedeki oku seçin. Sensör kartuş plakasını yüklemek için bir istem görüntülenir.
Sensör kartuş plakasının, anımsatıcı ekranındaki talimatları izleyerek doğru yönde yüklendiğinden emin olun. Solunum cihazı artık kartuşun dengesini sağlayacaktır. Hücre plakasının sekiz kuyuve çevresindeki rezervuarların her birine 200 mikrolitre M9 tamponekleyin.
Her bir suştan yaklaşık 100 solucanı tohumsuz NGM plakaları üzerine alın ve 2-3 dakika dinlendirin. Daha sonra, M9 tampon ile platin almak sonuna ıslak ve arka plan kuyuları A ve H boş bırakarak, G ile b kuyuları içine 20 yaş senkronize hayvanlar almak. Şimdi, kalibrasyon arabelleği içeren plakayı çıkarmak için solunum yazılımına Tamam'ı tıklayın.
Sensörün kartuşunu cihazın içinde bırakarak plakayı solunum cihazından çıkarın. Kalibrant plakasını hayvanları içeren plakaile değiştirin. Plakaları yükleyin ve vurarak kapıyı kapatın devam edin ve tazyikin çalışmasına izin verin.
Tdeneme çalışması tamamlandıktan sonra, hücre plakasını ve sensör kartuşu çıkarmak için ekrandaki istemleri izleyin. Çalışan veri savaş biçimini kaydetmek için USB bağlantı noktasına bir flash sürücü ekleyin. Sensör kartuşu çıkarın ve hayvanların yaklaşık iki dakika boyunca kuyuların dibine yerleşmesine izin verin.
Hücre plakalarını stereo bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin ve her kuyudaki hayvan sayısını sayın. Oksijen tüketim oranlarını hayvan sayısına göre normalleştirmek için normalleştirme sekmesini izleyen analiz yazılımını açın. Değiştir sekmesi altındaki çeşitli gruplar için uygun düzeyleri uygulayın ve daha fazla analiz için dosyayı prizma dosyası olarak dışa aktarın.
İlk beş ölçümün ortalaması bazal OCR'dir. FCCP ilavesi sonrası beş ölçümün ortalaması maksimal OCR'dir. Son olarak, sodyum azid ilavesi sonrası son beş ölçümün ortalaması mitokondriyal olmayan solunum oranıdır.
Kalsiyum disregülasyonu mitokondriyal fonksiyonda değişikliğe neden olabileceğinden, sel-12 mutasyonlarının ve yabani tip hayvanlarda OCR ölçüldü ve sel-12 mutasyonlarının mitokondriyal fonksiyon ve sağlık üzerindeki etkisini incelemek için ölçüldü. Vahşi tip hayvanlar sürekli solucan başına, dakikada beş picomoles altında bazal OCR oranları gösterdi. Sel-12 mutantlarının üç suşları solucan başına dakikada yaklaşık yedi pikomoles, ocr önemli ölçüde yüksek gösterdi iken.
FCCP eklenmesi üzerine, yabani tip OCR bir artış oldu, yanı sıra sel-12 mutantlar, beklendiği gibi. Yabani tip hayvanlar solucan başına dakikada yaklaşık yedi pikomoles maksimum OCR gösterdi. Sel-12 mutantları dakikada yaklaşık 10 pikomoles OCR iken, solucan başına.
Bu teşrinde canlı, iyi beslenmiş ve senkronize edilmiş hayvanları kullanın ve yumurta veya leşlerin istinat kuyularına aktarılmasından kaçının. Ayrıca, cihazın iç sıcaklığı 25 santigrat dereceyi geçmemelidir. Çamaşır suyu, FCCP, FUdR ve sodyum azid toksiktir.
Bu nedenle, stok çözümleri nin hazırlanması ve ilaç yüklemesi sırasında koruyucu eldiven takmaya özen verilmelidir.
