La funzione mitocondriale è fondamentale per l'omeostasi cellulare e il tasso di consumo di ossigeno è un indicatore decisivo della salute mitocondriale. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per analizzare il tasso di consumo di ossigeno in C.elegans. Questo protocollo fa uso di C.elegans mobili dal vivo che forniscono una misurazione legale della funzione mitocondriale.
Elevando la necessità di isolare i mitocondri, un passo che potrebbe potenzialmente avere un effetto sulla sua integrità. Per iniziare, trasferire larve L4 di background genetici desiderati su un prato appena seminato di Escherichia coli su mezzi di crescita di nematodi o piastre NGM. Utilizzare almeno due piastre da 100 mm o tre piastre da 60 mm per ogni deformazione.
Incubare i vermi alla temperatura di crescita appropriata per tre o quattro giorni, o fino a quando le piastre non sono concentrate con un gran numero di uova e vermi gravidi. Lavare le uova e i vermi dalle piastre usando circa 6 millilitri di tampone M9 per un piatto di nematodi di 100 millimetri. Utilizzando pipette da pascolo in vetro, trasferire le uova e i vermi in singoli tubi di centrifuga da 15 millilitri per ogni ceppo.
Far girare i tubi di queste per tre minuti a 6.180 g. Dopo la centrifugazione, aspirare il tampone M9 mantenendo solo l'animale e il pellet di uova. Aggiungere da tre a quattro millilitri di soluzione di candeggina ad ogni tubo e vortice intermittente per sei minuti.
Quindi, aggiungere il buffer M9 per riempire ogni tubo e girare a 6.180 g per un minuto. Aspirare il supernatante e ripetere questo lavaggio con l'M9, tre volte. Dopo il lavaggio, spostare il pellet di uova in un tubo fresco da 15 millilitri contenente circa nove millilitri di tampone M9.
Sincronizzare i vermi appena nati nutando a 20 gradi Celsius per 16-48 ore. Dopo aver filato questi tubi a 6.180 g per 1,5 minuti, mettere gli animali L-1 sincronizzati su un prato appena seminato di OP50 su singole piastre NGM. Mantenere i piatti a 20 gradi Celsius fino a quando gli animali raggiungono lo stadio larvale L-4 dopo circa 42 ore.
In questo momento, utilizzare un piccone di platino per spostare le larve L4 su piastre NGM sementi OP50 contenenti 0,5 milligrammi per millilitro di FUdR per impedire alla progenie di produzione. Idratare la cartuccia del sensore aggiungendo 200 microlitri di acqua distillata a ciascun pozzo sulla piastra, assicurando che le sonde del sensore siano sommerse. Conservare i piatti durante la notte a temperatura ambiente.
Spegnere l'elemento riscaldante all'interno dell'interfaccia respirometro. Conservare la macchina all'interno di un incubatore di 15 gradi Celsius abbassa la temperatura interna alla macchina e impedisce agli animali di surriscaldarsi durante il test. Dopo l'incubazione notturna, pipettare e scartare l'acqua distillata utilizzata per idratare le sonde del sensore e sostituirla con 200 microlitri della soluzione di calibante in ogni pozzo.
Diluire la soluzione stock FCCP a FCCP da 100 micromolari in acqua distillata. Quindi, aggiungere 20 microlitri della soluzione diluita alla porta di iniezione A nella cartuccia del sensore. Aggiungere 22 microlitri di azidi di sodio da 400 millimolari alla porta di iniezione B della cartuccia del sensore.
Ora accendi il respirometro. Nella schermata iniziale selezionare Avvia e verranno visualizzate le pagine modello. Nella pagina dei modelli selezionare vuoto" o un modello progettato in precedenza.
Verrà visualizzata la pagina gruppi. Nella pagina gruppi, selezionare i pozzi A e H come pozzi di sfondo e assegnare i restanti sei pozzi in gruppi appropriati secondo il piano sperimentale. Accedere alla pagina del protocollo facendo clic sulla freccia in basso a destra e assicurarsi che l'equilibrato, il basale e le iniezioni uno e due pulsanti siano selezionati.
Regolare il numero di letture dell'OCR basale, nonché dell'OCR massimo e dell'OCR non mitocondriale. Selezionare la freccia nell'angolo in basso a destra. Verrà visualizzata una richiesta di caricamento della piastra della cartuccia del sensore.
Assicurarsi che la piastra della cartuccia del sensore sia caricata con il giusto orientamento, seguendo le istruzioni nella schermata del prompt del promemoria. Il respirametro ora equilibra la cartuccia. Aggiungere 200 microlitri di tampone M9 in ciascuno degli otto pozzi e serbatoi circostanti della piastra cellulare.
Raccogliere circa 100 vermi da ogni ceppo su piastre NGM non sementi e lasciare riposare per due o tre minuti. Quindi, bagnare la fine del piccone di platino con tampone M9 e raccogliere animali sincronizzati di 20 anni in pozzi da B a G, lasciando vuoti i pozzi di sfondo A e H. Ora, fare clic su OK sul software respirometro per espellere la piastra contenente il buffer di calibrazione.
Rimuovere la piastra dal respirometro lasciando la cartuccia del sensore all'interno dello strumento. Sostituire la piastra di calibante con la piastra contenente gli animali. Caricare le piastre e chiudere la porta colpendo continuare e lasciare correre il saggio.
Una volta completata l'esecuzione del test, seguire le istruzioni visualizzate per rimuovere la piastra cellulare e la cartuccia del sensore. Inserire un'unità flash nella porta USB per salvare il formato run data war. Rimuovere la cartuccia del sensore e consentire agli animali di depositarsi sul fondo dei pozzi per circa due minuti.
Posizionare le lastre cellulari al microscopio stereo sezionando e contare il numero di animali per pozzo. Aprire il software di analisi, seguito dalla scheda di normalizzazione, per normalizzare i tassi di consumo di ossigeno al numero animale. Applicare i livelli appropriati per i vari gruppi nella scheda modifica ed esportare il file come file prisma per ulteriori analisi.
La media delle prime cinque misurazioni è l'OCR basale. La media delle cinque misurazioni dopo l'aggiunta di FCCP è l'OCR massimo. Infine, la media delle ultime cinque misurazioni dopo l'aggiunta di azide di sodio è il tasso di respirazione non mitocondriale.
Poiché la disregolazione del calcio può comportare una funzione mitocondriale alterata, l'OCR sia nei mutanti sel-12 che negli animali di tipo selvatico è stato misurato per esaminare l'effetto delle mutazioni sel-12 sulla funzione mitocondriale e sulla salute. Gli animali di tipo selvatico mostravano costantemente tassi di OCR basali inferiori a cinque picomoli al minuto, per verme. Mentre tutti e tre i ceppi di mutanti sel-12 mostravano un OCR significativamente elevato, di circa sette picomoli al minuto, per verme.
Con l'aggiunta di FCCP, c'è stato un aumento dell'OCR di tipo selvaggio, così come dei mutanti sel-12, come previsto. Gli animali di tipo selvatico hanno mostrato un OCR massimo di circa sette picomoli al minuto, per verme. Mentre i mutanti sel-12 avevano OCR di circa 10 picomoli al minuto, per verme.
Usa animali vivi, ben nutriti e sincronizzati in questo saggio ed evita il trasferimento di uova o carcasse in pozzi di dosaggio. Inoltre, la temperatura interna dello strumento non dovrebbe superare i 25 gradi Celsius. Candeggina, FCCP, FUdR e azide di sodio sono tossici.
Pertanto, si deve fare attenzione a indossare guanti protettivi durante la preparazione di soluzioni stock e il carico di farmaci.
