DREADDs هي النهج الكيميائي الأكثر شعبية للتحكم عن بعد من نشاط الخلايا العصبية. هنا نقدم بدائل جديدة للتحكم في DREADD المتكررة أو المزمنة ، مع التركيز على طرق توصيل CNO أقل توغلًا. نحن نصف استراتيجيتين للتسليم CNO لفترات طويلة في الفئران عن طريق قطرات العين المتكررة، أو بشكل مزمن من خلال مياه الشرب الحيوانية.
البروتوكولات المذكورة هنا هي أمثلة على الخيارات المزمنة وغير الباضعة للتسليم CNO التي يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من التصاميم التجريبية بما في ذلك المتغيرات DREADD المختلفة ، والأنسجة ، أو حتى الأنواع. القضية الرئيسية لتسليم CNO هو الإجهاد والألم الحيوان. هذه البروتوكولات تقليل هذه المشكلة وسهلة الأداء والتكيف مع إعدادات تجريبية مختلفة.
قبل إجراء الجراحة، تنظيف وتعقيم الإطار stereotaxic وجميع الصكوك اللازمة. عندما يكون الإطار جاهزًا ، تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع في خلفية مختلطة من نوع وحشي مُجَذَّن ، حلق الجزء العلوي من الرأس ، وإصلاح رأس الماوس إلى الإطار. ثم تطبيق مواد التشحيم واقية العين على العينين وأخيرا، تنظيف الجلد المكشوفة مع اليود povidone متتابعة و 70٪ من الدعك الإيثانول.
استخدام مشرط معقمة لفضح الجمجمة ومعايرة الإطار إلى نقطة bregma. حفر في إحداثي متوسط من 2.9 ملليمتر، واحداثي خلفي من ناقص 2.7 ملليمتر لاستهداف الحصين. عندما يتعرض الدماغ، واستخدام الحقن الدقيقة وسحبت ماصة ميكرو كابيليري لحقن من جانب واحد 90 نانويترات من الفيروس adenoassociated في قرن آمون في عمق البطن الظهرية من ناقص ثلاثة ملليمترات.
ثم أغلق الشق مع خياطة النايلون ، وإزالة الحيوان من الإطار لإدارة المسكنات. للتسليم CNO المتكررة ، تبدأ أربعة أسابيع بعد الحقن ، التأقلم مع الحيوانات للتعامل مع عن طريق scruffing كل فأرة ثلاث دقائق يوميا لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام قبل إعطاء قطرات العين. عندما أصبحت الفئران متأقلمة مع التعامل، تزن كل ماوس لتحديد الكمية المناسبة من CNO ليتم تسليمها لتحقيق واحد ملليغرام من CNO لكل كيلوغرام من تركيز وزن الجسم.
قبل ساعتين من الأضواء خلال المرحلة الخاملة ، قم بتحميل واحد إلى ثلاثة ميكرولترات من محلول CNO المعد في p10 micropipette وشل حركة الماوس عن طريق scruffing. طرد المحلل ببطء حتى تتشكل قطرات ثابتة على طرف الماصات و أحضر القطرة بعناية بالقرب من القرنية حتى يتم تسليم المحلل دون لمس طرف الماصات إلى عين الماوس. ثم العودة إلى قفص الماوس المنزل قبل تطبيق قطرة العين CNO إلى عين الحيوان المقبل.
في الحالات التي تحتاج إلى تسليم CNO أثناء مرحلة الماوس النشطة، تأكد من وجود ضوء أحمر خافت للتعامل مع الحيوانات السليمة والتسليم CNO. لعلاج CNO المزمن، ابتداء من أربعة أسابيع بعد الحقن وثلاثة أيام قبل بدء العلاج، واستبدال زجاجات المياه العادية مع زجاجات صغيرة توقفت مع صنبور المطاط ومغطاة مع رقائق الألومنيوم التي تحتوي على 10 ملليلتر من المياه العادية. آمن إلى الأقفاص مع الشريط للسماح للفئران بالتأقلم مع الزجاجات.
قياس استهلاك المياه اليومية لكل فأر، ووزنها كل الماوس. اختبار مجموعة من تركيزات CNO لتحديد الجرعة التي تعرض أقصى قدر من الفعالية مع الحد الأدنى من تركيز CNO. ثم تعبئة كل زجاجة صغيرة مع ثمانية ملليلتر من المياه العادية بالإضافة إلى الكمية المطلوبة من CNO.
لمعالجة CNO المقيدة، ابتداء من أربعة أسابيع بعد الحقن وثلاثة أيام قبل بدء العلاج، ووضع زجاجة صغيرة تحتوي على 10 ملليلتر من الماء بالإضافة إلى 1٪ السكروز على القفص بعيدا عن زجاجة المياه الأصلية خلال الجزء الأخير من المرحلة النشطة للحيوان. في نهاية التعرض، وإزالة المياه بالإضافة إلى محلول السكروز من كل قفص وقياس استهلاك المياه السكروز لكل. بالنسبة لـ CNO، املأ الزجاجات بخمسة ملليلترات من الماء بالإضافة إلى 1٪ سكروز ومليغرام واحد لكل كيلوغرام من CNO.
وضع زجاجة في نفس الموقف كما هو الحال خلال فترة تأقلم الماء السكر خلال الجزء الأخير من المرحلة النشطة، وإزالة الزجاجات وقياس كمية المياه والسكروز وCNO المستهلكة كما هو موضح. في نهاية التجربة، حصاد الدماغ الحيوانية المعالجة في تثبيت جديدة. بعد 9 إلى 12 ساعة، cryoprotect أنسجة الدماغ في محلول السكروز 30٪.
عندما يغرق الدماغ، قسم العينة على التبريد. عندما تم الحصول على جميع أقسام الدماغ والربط غير محدد سدت، احتضان عينات الأنسجة مع محلول الأجسام المضادة المضادة C-C-فوس في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع التحريض المستمر. في صباح اليوم التالي، وغسل العينات مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة لكل غسل قبل احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة.
بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة والهياج المستمر المحمية من الضوء، والحصول على الصور الرقمية من أقسام الأنسجة المسمى عن طريق المنظار المجهري الفلوري. بعد تحميل الصور في ImageJ ، outline في قياس مناطق الخلايا الإيجابية المصابة في أدينو المصابة وتقيّم عدد الخلايا الإيجابية الخاطئة C داخل هذه المنطقة للحصول على عدد الخلايا المنشطة لكل منطقة. المتكررة CNO التسليم باستخدام قطرات العين يثير تحريض قوي من التعبير cFos في معظم الخلايا العصبية المصابة مما يدل على أن فعالية تسليم CNO يتم الحفاظ عليها خلال التعرض المتكرر.
وعلاوة على ذلك، لوحظ تحريض كبير من cFos في العينات التي تم جمعها بعد ساعتين من العلاج CNO مقارنة مع العينات التي تم الحصول عليها بعد ست ساعات من التعرض CNO، مما يشير إلى أن التغيرات الناجمة عن CNO تعتمد على الوقت. الاستهلاك اليومي للمياه بالإضافة إلى CNO لا يختلف كثيرا بالمقارنة مع الحجم الإجمالي للمياه العادية المستهلكة. وبالمثل، فإن كمية المياه بالإضافة إلى 1٪ من السكروز المستهلكة خلال الليل لا تتأثر بإضافة CNO، ولا الاختلافات في الاستهلاك اليومي لكل من المياه بالإضافة إلى CNO، والماء بالإضافة إلى السكروز بالإضافة إلى CNO لوحظت على مدى فترة تجريبية لمدة خمسة أيام.
على غرار تطبيق قطرات العين CNO ، لوحظ تحريض قوي من cFos بعد ساعتين ، ولكن ليس ست ساعات من الوصول إلى مياه الشرب CNO. بالإضافة إلى ذلك، هناك عتبة واضحة من فعالية CNO كما جرعة CNO منخفضة لا تثير تفعيل cFos مقارنة مع التحكم في المالحة، في حين أن الجرعات العالية تحفز على التعريفي cFos قوية ومماثلة. نوصي بإجراء تحليل استجابة جرعة لتحديد أدنى جرعة CNO التي لا تقلل بشكل كبير تنشيط الخلايا العصبية, والنظر في استخدام كلوزابين باعتبارها يغاند.
هنا أظهرنا باستخدام cFos بوساطة CNO التعريفي نتيجة لتنشيط الخلايا العصبية. ومع ذلك، يمكن اعتماد هذه البروتوكول بسهولة للتحليل الكهربائي أو الاختبارات السلوكية. إن تقنية DREADD هي أداة قوية للتحكم عن بعد في نشاط الخلايا العصبية، وتصميم استراتيجيات بديلة لتوصيل CNO.
سنزيد من مجموعة الخيارات للبيئات التجريبية والتدخلات السريرية المحتملة.
