DREADDs는 신경 활동의 원격 제어를 위한 가장 인기 있는 화학 요법 접근 법. 여기서 우리는 덜 침습적 CNO 전달 방법에 초점을 맞추고 반복적 또는 만성 DREADD 제어를위한 새로운 대안을 제공합니다. 우리는 반복적인 점안액에 의하여 마우스에 있는 장기간된 CNO 납품을 위한 2개의 전략을 기술합니다, 또는 동물의 식수를 통해 만성적으로.
여기에 설명된 프로토콜은 다른 DREADD 변이체, 조직 또는 종을 포함하여 다양한 실험 설계에 적응할 수 있는 CNO 납품을 위한 만성 및 비침습적 선택권의 예입니다. CNO 배달의 주요 문제는 동물의 스트레스와 통증입니다. 이러한 프로토콜은 이 문제를 최소화하며 다양한 실험 설정에 쉽게 수행하고 적응할 수 있습니다.
수술을 수행하기 전에 스테레오 탁스 프레임과 필요한 모든 악기를 청소하고 살균하십시오. 프레임이 준비되면 마취 된 혼합 배경 야생 형 남성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 응답부족을 확인하고 머리 의 상단을 면도하고 마우스의 머리를 프레임에 고정시하십시오. 그런 다음 안구 보호 윤활유를 눈에 바르고 마지막으로 순차적인 포비도네 요오드와 70 % 에탄올 스크럽으로 노출된 피부를 청소하십시오.
멸균 메스를 사용하여 두개골을 노출하고 골격을 bregma 지점으로 보정합니다. 2.9밀리미터의 중간 좌표로 드릴링하고, 전방 후방 좌표가 영하 2.7밀리미터의 좌표를 사용하여 해마를 표적으로 한다. 뇌가 노출되면 마이크로 인젝터를 사용하여 마이크로 인젝터를 사용하여 adenoassociated 바이러스의 90 나노리터를 영하 3mm의 등쪽 복부 깊이에서 해마에 일방적으로 주입하십시오.
그런 다음 나일론 봉합사로 절개를 닫고 진통 투여를 위해 프레임에서 동물을 제거합니다. 반복적인 CNO 전달의 경우, 4주 후 주입을 시작으로, 각 마우스를 3~4일 동안 매일 3분씩 스크러핑하여 동물을 처리하도록 적응한다. 마우스가 처리에 익숙해지면, 각 마우스의 무게를 측정하여 체체중 농도의 킬로그램당 CNO의 1밀리그램을 달성하기 위해 전달되는 적절한 양의 CNO를 결정한다.
비활성 단계에서 불이 꺼지기 2시간 전에 준비된 CNO 용액의 1~3마이크로리터를 P10 마이크로파이프에 적재하고 스크러핑을 통해 마우스를 고정합니다. 파이펫 팁에 안정된 액적이 형성될 때까지 용액을 천천히 배출하고 피펫 끝을 마우스눈에 건드리지 않고 용액이 전달될 때까지 물방울을 각막 가까이에 두십시오. 그런 다음 다음 동물의 눈에 CNO 안약을 적용하기 전에 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
마우스 활성 단계에서 CNO를 전달해야 하는 경우 적절한 동물 취급 및 CNO 전달을 위해 희미한 빨간색 표시등이 있는지 확인합니다. 만성 CNO 치료의 경우, 4 주 후 주입 및 치료를 시작하기 3 일 전에 일반 물병을 고무 주물로 멈추고 일반 물 10 밀리리터가 들어있는 알루미늄 호일로 덮인 작은 병으로 교체하십시오. 쥐가 병에 적응할 수 있도록 테이프로 케이지에 고정하십시오.
각 마우스의 일일 물 소비를 측정하고 각 마우스의 무게를 측정합니다. 최소한의 CNO 농도로 최대 효과를 표시하는 용량을 결정하기 위해 다양한 CNO 농도를 테스트합니다. 그런 다음 각 작은 병을 8 밀리리터의 일반 물과 필요한 양의 CNO로 채웁니다.
제한된 CNO 치료의 경우, 4 주 후 주입을 시작하고 치료를 시작하기 3 일 전에, 동물의 활성 단계의 마지막 부분 동안 원래 물 병에서 멀리 10 밀리리터 플러스 1 %의 자당을 포함하는 작은 병을 케이지에 놓습니다. 노출이 끝나면 각 케이지에서 물과 자당 용액을 제거하고 각 동물에 대한 자당 물 소비를 측정합니다. CNO 배달의 경우 병을 5 밀리리터의 물과 1% 자당, CNO 킬로그램당 1밀리그램으로 채우하십시오.
활성 단계의 마지막 부분 동안 설탕 물 적응 기간 동안과 동일한 위치에 병을 배치, 병을 제거하고 활성으로 소비 된 물, 자당 및 CNO의 양을 측정. 실험이 끝나면 치료된 동물 뇌를 신선한 고정제로 수확하십시오. 9~12시간 후에, 냉동은 30% 자당 용액으로 뇌 조직을 보호합니다.
뇌가 가라앉으면 극저온에 샘플을 섹션으로 바침합니다. 모든 뇌 단면이 얻어지고 비특이적 결합이 막히면, 조직 샘플을 지속적인 동요로 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 항-C-Fos 항체 용액으로 배양한다. 다음 날 아침, 적절한 형광이 결합된 이차 항체로 시료를 배양하기 전에 세척당 신선한 PBS로 3개의 5분 세척으로 샘플을 세척합니다.
실내 온도에서 1 시간 후 빛으로부터 보호 일정한 동요, 형광 공초점 현미경 에 의해 표시 된 조직 섹션의 디지털 이미지를 얻을. ImageJ에 이미지를 로드한 후, 아데노-연관된 감염된 mCherry 양성 세포의 영역을 측정하고 영역당 활성화된 세포 수를 얻기 위해 이 영역 내의 C 거짓 양성 세포의 수를 정량화한다. 점안액을 이용한 반복적인 CNO 전달은 CNO 전달의 효과가 반복노출 중에 지속된다는 것을 보여주는 대부분의 감염된 뉴런에서 cFos 발현의 강력한 유도를 유도합니다.
더욱이, CNO 노출 후 6시간 후에 수득된 시료에 비해 CNO 처리 후 2시간 후에 수집된 샘플에서 cFos의 중요한 유도가 관찰되며, 이는 CNO에 의해 유도된 변화가 시간에 따라 달라진다는 것을 나타낸다. 물과 CNO의 일일 소비량은 소비된 일반 물의 총 부피와 크게 다르지 않습니다. 유사하게, 밤에 소비되는 물량과 1%의 자당은 CNO의 첨가에 의해 영향을 받지 않으며, 5일간의 실험 기간 동안 관찰된 물 플러스 CNO, 물 플러스 자당 플러스 CNO의 일일 소비에 차이가 없습니다.
CNO 점안액의 적용과 유사하게, cFos의 강력한 유도는 2 후에 관찰됩니다, 그러나 CNO 식수 접근의 6 시간. 또한, CNO 투여량이 낮을수록 식염수 조절에 비해 cFos 활성화를 유도하지 않는 반면, 더 높은 용량은 견고하고 유사한 cFos 유도를 유도하기 때문에 CNO에 대한 명확한 효과 임계값이 있다. 신경 활성화를 크게 감소시키지 않는 가장 낮은 CNO 용량을 정의하기 위해 용량 반응 분석을 수행하고, 리간드로서의 사용 클로자핀을 고려하는 것이 좋습니다.
여기에서 우리는 신경 활성화의 결과로 CNO 매개 cFos 유도를 사용하여 시연했습니다. 그러나, 이러한 프로토콜은 전기 생리학적 분석 또는 행동 시험에 쉽게 채택될 수 있다. DREADD 기술은 신경 활동의 원격 제어를 위한 강력한 도구이며 CNO 전달을 위한 대체 전략을 설계합니다.
우리는 실험 적인 설정 및 잠재적인 임상 내정간섭을 위한 선택권의 스펙트럼을 증가할 것입니다.
