DREADDs sind der beliebteste chemogenetische Ansatz für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität. Hier bieten wir neue Alternativen zur repetitiven oder chronischen DREADD-Steuerung, die sich auf weniger invasive CNO-Liefermethoden konzentrieren. Wir beschreiben zwei Strategien für die verlängerte CNO-Entbindung bei Mäusen durch sich wiederholende Augentropfen oder chronisch durch das Trinkwasser des Tieres.
Die hier beschriebenen Protokolle sind Beispiele für chronische und nichtinvasive Optionen für die CNO-Bereitstellung, die an eine Vielzahl von experimentellen Designs angepasst werden können, einschließlich verschiedener DREADD-Varianten, Gewebe oder sogar Arten. Ein zentrales Thema für eine CNO-Lieferung ist der Stress und der Schmerz eines Tieres. Diese Protokolle minimieren dieses Problem und sind einfach durchzuführen und an verschiedene experimentelle Einstellungen anzupassen.
Vor der Durchführung der Operation, reinigen und sterilisieren Sie den stereotaxic Rahmen und alle notwendigen Instrumente. Wenn der Rahmen bereit ist, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in einem anästhesierten gemischten Hintergrund wilde Typ männliche Maus, rasieren Sie die Oberseite des Kopfes, und fixieren Sie den Kopf der Maus auf den Rahmen. Dann okulares Schutzschmiermittel auf die Augen auftragen und schließlich die exponierte Haut mit sequentiellem Povidonjod und 70% Ethanolpeelings reinigen.
Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Schädel freizulegen und den Rahmen auf den Bregma-Punkt zu kalibrieren. Bohren Sie an einer medialateralen Koordinate von 2,9 Millimetern und einer vorderen hinteren Koordinate von minus 2,7 Millimetern, um den Hippocampus anzugreifen. Wenn das Gehirn exponiert ist, verwenden Sie einen Mikroinjektor und gezogene Mikrokapillarpipetten, um einseitig 90 Nanoliter des adenoassoziierten Virus in den Hippocampus mit einer dorsalen ventralen Tiefe von minus drei Millimetern zu injizieren.
Schließen Sie dann den Schnitt mit Nylonnähten, und entfernen Sie das Tier aus dem Rahmen für die Analgesie-Verabreichung. Für eine wiederholte CNO-Lieferung, beginnend vier Wochen nach der Injektion, akklimatisieren Sie die Tiere zu behandeln, indem Sie jede Maus drei Minuten täglich für drei bis vier Tage vor der Verabreichung der Augentropfen scruffing. Wenn die Mäuse sich an die Handhabung gewöhnt haben, wiegen Sie jede Maus, um die entsprechende Menge an CNO zu bestimmen, die geliefert werden soll, um ein Milligramm CNO pro Kilogramm Körpergewichtskonzentration zu erreichen.
Zwei Stunden vor dem Ausleuchten während der inaktiven Phase ein bis drei Mikroliter der vorbereiteten CNO-Lösung in eine P10-Mikropipette laden und die Maus durch Scruffing immobilisieren. Die Lösung langsam austreiben, bis sich ein stabiles Tröpfchen auf der Pipettenspitze bildet, und das Tröpfchen vorsichtig in die Nähe der Hornhaut bringen, bis die Lösung geliefert wird, ohne die Pipettenspitze an das Auge der Maus zu berühren. Dann kehren Sie die Maus in ihren Hauskäfig zurück, bevor Sie die CNO-Augenkeinedes auf das Auge des nächsten Tieres auftragen.
In Fällen, in denen CNO während der aktiven Mausphase geliefert werden muss, stellen Sie sicher, dass ein dim rotes Licht für die ordnungsgemäße Handhabung von Tieren und die CNO-Lieferung auftritt. Für die chronische CNO-Behandlung, beginnend vier Wochen nach der Injektion und drei Tage vor Beginn der Behandlung, ersetzen Sie die regulären Wasserflaschen mit kleinen Flaschen gestoppt mit Gummiausläufen und bedeckt mit Aluminiumfolie mit 10 Milliliter normales Wasser bedeckt. Sichern Sie die Käfige mit Klebeband, damit sich Mäuse an die Flaschen akklimatisieren können.
Messen Sie den täglichen Wasserverbrauch für jede Maus und wiegen Sie jede Maus. Testen Sie eine Reihe von CNO-Konzentrationen, um die Dosis zu bestimmen, die die maximale Wirksamkeit mit der minimalen CNO-Konzentration anzeigt. Dann füllen Sie jede kleine Flasche mit acht Milliliter n. Wasser zuzüglich der erforderlichen Menge CNO.
Für eine eingeschränkte CNO-Behandlung, beginnend vier Wochen nach der Injektion und drei Tage vor Beginn der Behandlung, legen Sie eine kleine Flasche mit 10 Milliliter Wasser plus 1%Saccharose auf den Käfig weg von der ursprünglichen Wasserflasche während der letzten Portion der aktiven Phase des Tieres. Am Ende der Exposition entfernen Sie das Wasser plus Saccharoselösungen aus jedem Käfig und messen Sie den Saccharosewasserverbrauch für jedes Tier. Für die CNO-Lieferung die Flaschen mit fünf Milliliter Wasser plus 1%Saccharose und einem Milligramm pro Kilogramm CNO füllen.
Stellen Sie die Flasche während der Zeit während der Zuckerwasserakklimatisierungwährend während der letzten Phase der aktiven Phase in die gleiche Position wie während der Zuckerwasserakklimatisierungsphase, entfernen Sie die Flaschen und messen Sie die Menge an Wasser, Saccharose und CNO, wie gezeigt. Am Ende des Experiments, ernten Sie das behandelte Tier Gehirn in frische Fixierung. Nach 9 bis 12 Stunden, kryoprotect das Gehirngewebe in einer 30%Saccharose-Lösung.
Wenn das Gehirn sinkt, abschnitt die Probe auf einem Kryostat. Wenn alle Hirnabschnitte erhalten und die unspezifische Bindung blockiert sind, inkubieren Sie die Gewebeproben mit einer Anti-c-Fos-Antikörperlösung bei vier Grad Celsius über Nacht mit ständiger Erregung. Am nächsten Morgen die Proben mit drei fünfminütigen Waschungen in frischem PBS pro Waschgang waschen, bevor sie die Proben mit einem geeigneten fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper inkubieren.
Nach einer Stunde bei Raumtemperatur und ständiger, lichtgeschützter Rührung erhalten Sie digitale Bilder der beschrifteten Gewebeabschnitte durch fluoreszenzkonfokokale Mikroskopie. Nach dem Laden der Bilder in ImageJ, umreißen Sie die Bereiche der Adeno-assoziierten infizierten mCherry-positiven Zellen und quantifizieren die Anzahl der C falsch positiven Zellen innerhalb dieses Bereichs, um die Anzahl der aktivierten Zellen pro Fläche zu erhalten. Eine wiederholte CNO-Abgabe mit Augentropfen führt zu einer robusten Induktion der cFos-Expression in den meisten infizierten Neuronen, die zeigen, dass die Wirksamkeit der CNO-Abgabe während der wiederholten Exposition aufrechterhalten wird.
Darüber hinaus wird eine signifikante Induktion von cFos in Proben beobachtet, die zwei Stunden nach der CNO-Behandlung entnommen wurden, verglichen mit Proben, die sechs Stunden nach Der CNO-Exposition erhalten wurden, was darauf hindeutet, dass durch CNO induzierte Veränderungen zeitabhängig sind. Der tägliche Verbrauch von Wasser plus CNO unterscheidet sich nicht wesentlich von der Gesamtmenge des regulären Wasserverbrauchs. Ebenso wird die Menge an Wasser plus 1%Saccharose, die in der Nacht verbraucht wird, nicht durch die Zugabe von CNO beeinflusst, ebenso wenig wie Unterschiede im täglichen Verbrauch von Wasser plus CNO und Wasser plus Saccharose plus CNO, die während eines fünftägigen Versuchszeitraums beobachtet wurden.
Ähnlich wie bei der Anwendung von CNO-Augentropfen wird eine robuste Induktion von cFos nach zwei, aber nicht sechs Stunden CNO-Trinkwasserzugang beobachtet. Darüber hinaus gibt es eine klare Wirksamkeitsschwelle für CNO, da eine niedrige CNO-Dosis keine cFos-Aktivierung im Vergleich zu einer Saline-Kontrolle hervorruft, während höhere Dosen eine robuste und ähnliche cFos-Induktion induzieren. Wir empfehlen, eine Dosis-Wirkungsanalyse durchzuführen, um die niedrigste CNO-Dosis zu definieren, die die neuronale Aktivierung nicht signifikant reduziert, und die Verwendung von Clozapin als Liganden zu berücksichtigen.
Hier demonstrierten wir die Verwendung von CNO-vermittelter cFos-Induktion als Ergebnis der neuronalen Aktivierung. Diese Protokolle können jedoch leicht für elektrophysiologische Analysen oder Verhaltenstests übernommen werden. Die DREADD-Technologie ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Fernsteuerung neuronaler Aktivität und zur Entwicklung alternativer Strategien für die CNO-Bereitstellung.
Wir werden das Spektrum der Optionen für experimentelle Einstellungen und potenzielle klinische Interventionen erweitern.
