I DREADD sono l'approccio chemiogenetico più popolare per il controllo remoto dell'attività neuronale. Qui offriamo nuove alternative per il controllo DREADD ripetitivo o cronico, concentrandosi su metodi di consegna CNO meno invasivi. Descriviamo due strategie per la somministrazione prolungata di CNO nei topi con colliri ripetitivi o cronicamente attraverso l'acqua potabile dell'animale.
I protocolli descritti qui sono esempi di opzioni croniche e non invasive per la consegna di CNO che possono essere adattate a una varietà di progetti sperimentali tra cui diverse varianti DREADD, tessuti o persino specie. Una questione chiave per la consegna di CNO è lo stress e il dolore di un animale. Questi protocolli riducono al minimo questo problema e sono facili da eseguire e adattare a diverse impostazioni sperimentali.
Prima di eseguire l'intervento chirurgico, pulire e sterilizzare il telaio stereotassico e tutti gli strumenti necessari. Quando il telaio è pronto, confermare la mancanza di risposta al dito del mouse in uno sfondo misto anestetizzato di tipo selvaggio maschio, radersi la parte superiore della testa e fissare la testa del mouse al telaio. Quindi applicare lubrificante protettivo oculare sugli occhi e, infine, pulire la pelle esposta con iodio povidone sequenziale e scrub al 70% di etanolo.
Utilizzare un bisturi sterile per esporre il cranio e calibrare il telaio al punto bregma. Forare con una coordinata medialaterale di 2,9 millimetri e una coordinata posteriore anteriore di meno 2,7 millimetri per colpire l'ippocampo. Quando il cervello è esposto, utilizzare un micro iniettore e tirato pipette microcapillari per iniettare unilateralmente 90 nanolitri del virus adenoassociato nell'ippocampo a una profondità ventrale dorsale di meno tre millimetri.
Quindi chiudere l'incisione con suture di nylon e rimuovere l'animale dal telaio per la somministrazione di analgesia. Per la consegna ripetitiva del CNO, a partire da quattro settimane dopo l'iniezione, acclimatare gli animali alla manipolazione scruffando ogni topo tre minuti al giorno per tre o quattro giorni prima della somministrazione dei colliri. Quando i topi si sono acclimatati alla manipolazione, pesare ogni topo per determinare la quantità appropriata di CNO da consegnare per ottenere un milligrammo di CNO per chilogrammo di concentrazione del peso corporeo.
Due ore prima che le luci si spengano durante la fase inattiva, caricare da uno a tre microlitri della soluzione CNO preparata in una micropipetta P10 e immobilizzare il mouse tramite scruffing. Espellere lentamente la soluzione fino a quando non si forma una goccia stabile sulla punta della pipetta e portare con cura la goccia vicino alla cornea fino a quando la soluzione non viene consegnata senza toccare la punta della pipetta all'occhio del mouse. Quindi riportare il mouse nella sua gabbia di casa prima di applicare il contagocce CNO all'occhio dell'animale successivo.
Nei casi in cui il CNO deve essere consegnato durante la fase attiva del mouse, garantire la presenza di una luce rossa fioca per una corretta manipolazione degli animali e la consegna del CNO. Per il trattamento cronico del CNO, a partire da quattro settimane dopo l'iniezione e tre giorni prima di iniziare il trattamento, sostituire le normali bottiglie d'acqua con piccole bottiglie fermate con beccucci di gomma e coperte con foglio di alluminio contenente 10 millilitri di acqua normale. Fissare alle gabbie con nastro adesivo per consentire ai topi di acclimatarsi alle bottiglie.
Misurare il consumo giornaliero di acqua per ogni mouse e pesare ogni mouse. Testare una gamma di concentrazioni di CNO per determinare la dose che mostra la massima efficacia con la concentrazione minima di CNO. Quindi riempire ogni piccola bottiglia con otto millilitri di acqua normale più la quantità richiesta di CNO.
Per un trattamento CNO limitato, a partire da quattro settimane dopo l'iniezione e tre giorni prima di iniziare il trattamento, posizionare una piccola bottiglia contenente 10 millilitri di acqua più l'1% di saccarosio sulla gabbia lontano dalla bottiglia d'acqua originale durante l'ultima porzione della fase attiva dell'animale. Al termine dell'esposizione, rimuovere l'acqua più le soluzioni di saccarosio da ciascuna gabbia e misurare il consumo di acqua di saccarosio per ciascun animale. Per la consegna del CNO, riempire le bottiglie con cinque millilitri di acqua più l'1% di saccarosio e un milligrammo per chilogrammo di CNO.
Posizionare la bottiglia nella stessa posizione del periodo di acclimatazione dell'acqua zuccherata durante l'ultima porzione della fase attiva, rimuovendo le bottiglie e misurando la quantità di acqua, saccarosio e CNO consumati come dimostrato. Alla fine dell'esperimento, raccogliere il cervello animale trattato in fresco fissatore. Dopo 9-12 ore, crioproteggere il tessuto cerebrale in una soluzione di saccarosio al 30%.
Quando il cervello affonda, sessare il campione su un criostato. Quando tutte le sezioni cerebrali sono state ottenute e il legame non specifico bloccato, incubare i campioni di tessuto con una soluzione anticorpale anti-c-Fos a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione costante. La mattina successiva, lavare i campioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS fresco per lavaggio prima di incubare i campioni con un anticorpo secondario coniugato a fluorescenza appropriato.
Dopo un'ora a temperatura ambiente e agitazione costante protetta dalla luce, ottenere immagini digitali delle sezioni tissutali etichettate mediante microscopia confocale a fluorescenza. Dopo aver caricato le immagini in ImageJ, delineare a misura le aree delle cellule positive mCherry infette associate ad Adeno e quantificare il numero di cellule false positive C all'interno di questa regione per ottenere il numero di cellule attivate per area. La somministrazione ripetitiva di CNO utilizzando colliri provoca una robusta induzione dell'espressione cFos nella maggior parte dei neuroni infetti dimostrando che l'efficacia della consegna di CNO è sostenuta durante l'esposizione ripetitiva.
Inoltre, nei campioni raccolti due ore dopo il trattamento con CNO si osserva un'induzione significativa di cFos rispetto ai campioni ottenuti sei ore dopo l'esposizione al CNO, il che indica che i cambiamenti indotti dal CNO dipendono dal tempo. Il consumo giornaliero di acqua più CNO non è significativamente diverso rispetto al volume totale di acqua normale consumata. Analogamente, la quantità di acqua più l'1% di saccarosio consumata durante la notte non è influenzata dall'aggiunta di CNO, né le differenze nel consumo giornaliero di acqua più CNO, e acqua più saccarosio più CNO osservate in un periodo sperimentale di cinque giorni.
Simile all'applicazione dei colliri CNO, una robusta induzione di cFos si osserva dopo due, ma non sei ore di accesso all'acqua potabile CNO. Inoltre, esiste una chiara soglia di efficacia per il CNO in quanto una bassa dose di CNO non provoca l'attivazione di cFos rispetto a un controllo salino, mentre dosi più elevate inducono un'induzione cFos robusta e simile. Si consiglia di eseguire un'analisi della risposta alla dose per definire la dose cno più bassa che non riduce significativamente l'attivazione neuronale e considerando l'uso della clozapina come ligando.
Qui abbiamo dimostrato di usare l'induzione cFos mediata da CNO come risultato dell'attivazione neuronale. Tuttavia, questi protocolli possono essere facilmente adottati per l'analisi elettrofisiologia o i test comportamentali. La tecnologia DREADD è un potente strumento per il controllo remoto dell'attività neuronale e la progettazione di strategie alternative per la consegna del CNO.
Aumenteremo lo spettro di opzioni per ambienti sperimentali e potenziali interventi clinici.
