DREADDsは、神経活動の遠隔制御のための最も人気のある化学遺伝学的アプローチです。ここでは、より低侵襲のCNO送達方法に焦点を当てて、反復または慢性DREADD制御のための新しい選択肢を提供します。我々は、マウスにおける反復点眼薬による、または動物の飲料水を介して慢性的に長期にわたるCNO送達のための2つの戦略を説明する。
ここで説明するプロトコルは、異なるDREADD変異体、組織、あるいは種を含む様々な実験設計に適応することができるCNO送達のための慢性的および非侵襲的なオプションの例である。CNOの出産のための重要な問題は、動物のストレスと痛みです。これらのプロトコルは、この問題を最小限に抑え、さまざまな実験設定に簡単に適応できます。
手術を行う前に、ステレオタックスフレームと必要なすべての器具を清潔にして滅菌してください。フレームの準備ができたら、麻酔された混合背景野生型雄マウスでつまみつまみへの応答の欠如を確認し、頭の上を剃り、フレームにマウスの頭を固定します。次に眼保護潤滑剤を眼に塗布し、最後に、露出した皮膚をシーケンシャルなポビドンヨウ素と70%エタノールスクラブで洗浄します。
滅菌メスを使用して頭蓋骨を露出させ、フレームをブレグマポイントにキャリブレーションします。2.9ミリメートルの内側座標でドリルし、海馬を標的にするためにマイナス2.7ミリメートルの前後方座標で掘削します。脳が露出したら、マイクロインジェクターを使用し、マイクロキャピラリーピペットを引っ張って、過誤関連ウイルスの90ナノリットルをマイナス3ミリメートルの下側腹側深さで海馬に一方的に注入する。
次いでナイロン縫合糸で切開を閉じ、鎮痛投与用のフレームから動物を取り除く。反復的なCNO送達のために、注射後4週間開始、各マウスを眼球の投与の3〜4日間毎日3分をスクラフすることによって取り扱いに動物を順応させる。マウスが取り扱いに慣れてきたら、各マウスの重量を量って、体重濃度の1キログラム当たり1ミリグラムのCNOを達成するために送達されるCNOの適切な量を決定する。
不活性段階で消灯する2時間前に、調製したCNO溶液の1~3マイクロリットルをP10マイクロピペットにロードし、スクラッフィンを介してマウスを固定化します。ピペットチップに安定した液滴が形成されるまでゆっくりと溶液を排出し、ピペットチップに触れることなく溶液が送達されるまで慎重に液滴を角膜に近づけます。次に、マウスをホームケージに戻してから、次の動物の目にCNOのスポイトを塗布します。
マウスの活性段階でCNOを送達する必要がある場合は、適切な動物の取り扱いとCNOの送達のために薄暗い赤色光の存在を確認してください。慢性CNO治療の場合、注射後4週間、治療開始3日前に、通常の水筒をゴムスパウトで止め、通常の水10ミリリットルを含むアルミニウム箔で覆った小さなボトルに交換してください。マウスがボトルに順応できるようにテープでケージに固定します。
各マウスの毎日の水消費量を測定し、各マウスの重量を量ります。CNO濃度の範囲をテストして、最小のCNO濃度で最大の効果を表示する用量を決定します。その後、各小さなボトルに8ミリリットルの通常の水と必要な量のCNOを充填します。
制限付きCNO治療の場合、注射後4週間、治療開始の3日前に、動物の活動期の最後の部分で、10ミリリットルの水と1%スクロースを含む小さなボトルをケージに置きます。露光の終わりに、各ケージから水とスクロース溶液を取り除き、各動物のスクロース水消費量を測定します。CNOの配達のために、5ミリリットルの水に加えて1%スクロースとCNOのキログラムあたり1ミリグラムでボトルを満たします。
活性相の最後の部分の間に砂糖水の順応期間中と同じ位置にボトルを置き、ボトルを取り除き、実証したように水、スクロースおよびCNOの消費量を測定する。実験の終わりに、処理された動物の脳を新鮮な固定剤に収穫する。9~12時間後、30%スクロース溶液で脳組織を凍結保護する。
脳が沈んだら、クライオスタットのサンプルを切り離します。すべての脳切片が得られ、非特異的結合がブロックされたら、一定の攪拌で一晩摂氏4度で抗c-Fos抗体溶液で組織サンプルをインキュベートする。翌朝、適切な蛍光共役二次抗体でサンプルをインキュベートする前に、洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の5分間の洗浄でサンプルを洗浄します。
光から保護された室温および一定の撹拌で1時間後、蛍光共焦点顕微鏡により標識された組織切片のデジタル画像を得る。ImageJに画像をロードした後、アデノ関連感染したmCherry陽性細胞の領域を測定し、この領域内のC偽陽性細胞の数を定量化して、領域あたりの活性化細胞数を得る。点眼薬を用いた反復的CNO送達は、ほとんどの感染ニューロンにおけるcFos発現の強い誘導を引き起こす。
さらに、CNO照射後6時間で得られたサンプルと比較して、CNO処理の2時間後に採取したサンプルにおいてcFosの有意な誘導が観察され、CNOによって誘発される変化が時間依存であることを示す。水とCNOの毎日の消費量は、通常の水の総量と比較して有意に異なっていません。同様に、夜間に消費される水の量に1%のスクロースを加えた量は、CNOの添加によって影響を受けず、また、水とCNOの両方の毎日の消費の違いはなく、水プラススクロースとCNOの5日間の実験期間にわたって観察された。
CNO点眼薬の適用と同様に、cFosの堅牢な誘導は2時間後に観察されるが、CNO飲料水へのアクセスの6時間は観察されない。さらに、CNOの有効性の明確な閾値は、低いCNO用量が生理食類対照と比較してcFos活性化を引き起こすのではなく、より高い用量は堅牢で類似したcFos誘導を誘発する。ニューロンの活性化を有意に低下させない最も低いCNO用量を定義するために用量応答分析を行い、リガンドとしてクロザピンを使用することを検討することをお勧めします。
ここでは、ニューロン活性化の結果としてCNO媒介cFos誘導を用いて実証した。しかし、これらのプロトコルは、電気生理学的解析や行動試験に容易に採用することができる。DREADD技術は、ニューロン活動の遠隔制御、およびCNO配信のための代替戦略を設計するための強力なツールです。
実験的な設定と潜在的な臨床介入のためのオプションのスペクトルを増やします。
