DREADDs הם הגישה הכימתוגנטית הפופולרית ביותר עבור שליטה מרחוק של פעילות עצבית. כאן אנו מציעים חלופות חדשות לבקרת DREADD חוזרת או כרונית, תוך התמקדות בשיטות אספקה פחות פולשניות של CNO. אנו מתארים שתי אסטרטגיות למסירה ממושכת של CNO בעכברים על ידי טיפות עיניים חוזרות ונשנות, או באופן כרוני דרך מי השתייה של החיה.
הפרוטוקולים המתוארים כאן הם דוגמאות לאפשרויות כרוניות ולא פולשניות לאספקת CNO שניתן להתאים למגוון עיצובים ניסיוניים כולל גרסאות DREADD שונות, רקמות או אפילו מינים. נושא מפתח עבור משלוח CNO הוא מתח וכאב של בעל חיים. פרוטוקולים אלה ממזערים בעיה זו וקלים לביצוע והתאמה להגדרות ניסיוניות שונות.
לפני ביצוע הניתוח, לנקות ולעקר את המסגרת הסטריאוטוקסית ואת כל המכשירים הדרושים. כאשר המסגרת מוכנה, אשר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר זכר מסוג בר מעורב עם הרדמה, גילח את החלק העליון של הראש ותקן את ראש העכבר למסגרת. לאחר מכן להחיל חומר סיכה מגן עינית על העיניים ולבסוף, לנקות את העור החשוף עם יוד povidone רציף 70% קרצוף אתנול.
השתמש אזמל סטרילי לחשוף את הגולגולת ולכייל את המסגרת לנקודת bregma. מקדחים במתאם צבאי של 2.9 מילימטרים, וקואורדינטת אחורית של מינוס 2.7 מילימטרים כדי למקד את ההיפוקמפוס. כאשר המוח נחשף, השתמש במזרק מיקרו ומשך פיפטים מיקרו-אפילריים כדי להזריק באופן חד צדדי 90 ננוליטרים של הנגיף אדנושה לתוך ההיפוקמפוס בעומק הגחון הגבי של מינוס שלושה מילימטרים.
לאחר מכן לסגור את החתך עם תפרים ניילון, ולהסיר את החיה מהמסגרת עבור ניהול משכך כאבים. עבור משלוח CNO חוזר, החל מארבעה שבועות לאחר הזרקת, להתאקלם את בעלי החיים לטיפול על ידי scruffing כל עכבר שלוש דקות ביום במשך שלושה עד ארבעה ימים לפני הממשל של טיפות עיניים. כאשר העכברים התאקלמו לטיפול, לשקול כל עכבר כדי לקבוע את הכמות המתאימה של CNO להימסר כדי להשיג מיליגרם אחד של CNO לקילוגרם של ריכוז משקל הגוף.
שעתיים לפני כיבוי האורות במהלך השלב הלא פעיל, העמיסו 1-3 מיקרוליטרים של פתרון CNO המוכן למיקרופיגט P10 ושתקו את העכבר באמצעות קרלינג. לאט לגרש את הפתרון עד טיפה יציבה צורות על קצה פיפטה בזהירות להביא את הטיפה קרוב הקרנית עד הפתרון מועבר מבלי לגעת קצה פיפטה לעין העכבר. ואז להחזיר את העכבר לכלוב הבית שלה לפני החלת טיפת עיניים CNO על העין של החיה הבאה.
במקרים שבהם CNO צריך להיות מועבר במהלך השלב הפעיל של העכבר, להבטיח נוכחות של אור אדום עמום לטיפול נכון בבעלי חיים ומשלוח CNO. לטיפול CNO כרוני, החל מארבעה שבועות לאחר הזרקת ושלושה ימים לפני תחילת הטיפול, החלף את בקבוקי המים הרגילים בבקבוקים קטנים שנעצרו עם זרבוביות גומי ומכסים בנייר אלומיניום המכיל 10 מיליליטר מים רגילים. מאובטח לכלובים עם סרט הדבקה כדי לאפשר לעכברים להסתגל לבקבוקים.
למדוד את צריכת המים היומית עבור כל עכבר, ולשקול כל עכבר. בדוק מגוון של ריכוזי CNO כדי לקבוע את המינון המציג את האפקטיביות המרבית עם ריכוז CNO מינימלי. לאחר מכן מלאו כל בקבוק קטן בשמונה מיליליטר מים רגילים בתוספת הכמות הנדרשת של CNO.
לטיפול CNO מוגבל, החל מארבעה שבועות לאחר הזרקת ושלושה ימים לפני תחילת הטיפול, מניחים בקבוק קטן המכיל 10 מיליליטר מים בתוספת 1% סוכרוז על הכלוב הרחק מבקבוק המים המקורי בחלק האחרון של השלב הפעיל של החיה. בסוף החשיפה, להסיר את המים בתוספת פתרונות סוכרוז מכלוב ולמדוד את צריכת המים סוכרוז עבור כל בעל חיים. למשלוח CNO, מלאו את הבקבוקים בחמישה מיליליטר מים בתוספת 1% סוכרוז ומיליגרם אחד לקילוגרם של CNO.
מניחים את הבקבוק באותה תנוחה כמו במהלך תקופת התאקלמות מי הסוכר בחלק האחרון של השלב הפעיל, מסירים את הבקבוקים ומודדים את כמות המים, הסוכרוז וה- CNO הנצרכת כפי שהוכח. בסוף הניסוי, לקצור את המוח החייתי המטופל לתוך תיקון טרי. לאחר 9 עד 12 שעות, cryoprotect רקמת המוח בתסכום סוכרוז 30%.
כשהמוח שוקע, תקטע את הדגימה על קריוסטט. כאשר כל חלקי המוח הושגו והכריכה הלא ספציפית נחסמה, דגירה דגימות הרקמה עם פתרון נוגדנים נגד c-Fos בארבע מעלות צלזיוס לילה עם תסיסה מתמדת. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם שלוש שטיפות של חמש דקות PBS טרי לכל לשטוף לפני הדגירה את הדגימות עם פלואורסצנטיות מתאימה הצטייד נוגדן משני.
לאחר שעה בטמפרטורת החדר ותסיסה מתמדת המוגנת מפני אור, השג תמונות דיגיטליות של מקטעי הרקמה המסומן על ידי מיקרוקרוסקופיה קונפוקנטית פלואורסצנטית. לאחר טעינת התמונות לתוך ImageJ, חלוקה לרמות למדוד את האזורים של תאים חיוביים mCherry נגוע Adeno הקשורים לכמת את מספר C תאים חיוביים כוזבים בתוך אזור זה כדי לקבל את מספר התאים הפעילים לכל אזור. משלוח CNO חוזר באמצעות טיפות עיניים מעורר אינדוקציה חזקה של ביטוי cFos ברוב הנוירונים הנגועים המוכיחים כי האפקטיביות של משלוח CNO מתמשכת במהלך החשיפה החוזרת ונשנית.
יתר על כן, אינדוקציה משמעותית של cFos נצפתה בדגימות שנאספו שעתיים לאחר טיפול CNO בהשוואה לדגימות שהושגו שש שעות לאחר חשיפת CNO, מה שמצביע על כך ששינויים הנגרמים על ידי CNO תלויים בזמן. הצריכה היומית של מים בתוספת CNO אינה שונה באופן משמעותי בהשוואה לנפח הכולל של מים רגילים הנצרכים. באופן דומה, כמות המים בתוספת 1% סוכרוז הנצרכת במהלך הלילה אינה מושפעת מהתוספת של CNO, וגם לא הבדלים בצריכה היומית של מים פלוס CNO, ומים בתוספת סוכרוז בתוספת CNO שנצפו במשך תקופה ניסיונית של חמישה ימים.
בדומה ליישום של טיפות עיניים CNO, אינדוקציה חזקה של cFos נצפתה לאחר שעתיים, אבל לא שש שעות של גישה למי שתייה CNO. בנוסף, יש סף ברור של יעילות עבור CNO כמו מינון CNO נמוך אינו מעורר הפעלת cFos לעומת שליטה מלוחים, ואילו מינונים גבוהים יותר לגרום אינדוקציה cFos חזק דומה. אנו ממליצים לבצע ניתוח תגובת מינון כדי להגדיר את המינון הנמוך ביותר CNO שאינו מפחית באופן משמעותי את ההפעלה העצבית, ובהתחשב בשימוש clozapine כמו ligand.
כאן הדגמנו באמצעות אינדוקציה cFos מתווך CNO כתוצאה של הפעלה עצבית. עם זאת, פרוטוקולים אלה ניתן לאמץ בקלות ניתוח אלקטרופיזיולוגי או בדיקות התנהגותיות. טכנולוגיית DREADD היא כלי רב עוצמה לשליטה מרחוק בפעילות העצבית, ועיצוב אסטרטגיות חלופיות לאספקת CNO.
נגדביר את קשת האפשרויות להגדרות ניסיוניות והתערבויות קליניות אפשריות.
