هذه الطريقة تقدم طريقة لإنشاء السقالات المستمدة من الأنسجة الأصلية التي يمكن استخدامها لتجديد الغضاريف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يتم الحفاظ على مكونات الغضروف الأصلي في السقالات التي يمكن أن تعزز تشكيل الغضروف والتجدد في المختبر وفي الجسم الحي. على الرغم من أن هذه الطريقة تستخدم الغضروف من اكوين خنق المفاصل, الغضاريف من أي مفاصل أخرى يمكن استخدامها كذلك.
للبدء، والحصول على مفصل كادافيك سليمة لعزل الغضاريف وإزالة الجلد الدهون الزائدة والأنسجة العضلية كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. المقبل، وتحديد الموقع حيث يوضح المفصل من خلال تنفيذ تصريف التمديد للمفصل. إجراء شق أفقي للوصول إلى تجويف المفاصل.
بعد ذلك، قم بعمل شق عمودي لفتح منطقة المفصل. يتم تعبئة تجويف المفصل مع السائل الزليلي الذي من المرجح أن يقطر من تجويف عند إجراء شق الصحيح. الاستمرار في فتح المفصل تماما عن طريق إزالة الدهون المفرطة والعضلات والأوتار، وقطع من خلال الأوتار التي تحافظ على المفصل معا.
فحص بعناية الغضروف عن أي ضرر العيان. إذا لم يكن للغضروف المفصلي مظهر أكثر سلاسة أو إذا كانت الأدلة أو تقرحات أو شقوق أو عيوب موجودة ، فتخلص من الغضروف وتبدأ من جديد. استخدام مشرط معقمة لإزالة الغضروف من العظام.
قطع كل وسيلة وصولا الى عظم تحت الchondral لإزالة الغضروف المنطقة العميقة. جمع شرائح الغضروف إزالتها في أنابيب 50 ملليلتر تحتوي على محلول غسل الغضاريف المعدة مسبقًا. أثناء معالجتها، بالتنقيط بانتظام محلول غسل الغضروف على الغضروف لمنع الغضروف من الجفاف.
بعد جمع الغضاريف من جميع المناطق ذات الاهتمام، قم بتجميد شرائح الغضاريف في النيتروجين السائل لمدة خمس دقائق. ثم نقل شرائح الغضاريف إلى أنابيب 50 ملليلتر ووضع على الفور شرائح المجمدة في مجفف تجميد. lyophilize شرائح الغضروف لمدة 24 ساعة مع مجفف تجميد.
عند الانتهاء، قم بتخزين شرائح الغضروف المجففة المجمدة في مكان جاف في درجة حرارة الغرفة. للمعالجة اليدوية، قبل البرد هاون وحشرات مع النيتروجين السائل، ثم وضع شرائح الغضروف الlyophilized في هاون وغمرها والنيتروجين السائل. طحن العينات مباشرة باليد لمدة 45 دقيقة تقريبا حتى يتم سحقها بما فيه الكفاية.
بدلا من ذلك، لطحن العينات تلقائيا باستخدام آلة الطحن، تبدأ قبل التبريد حجرة طحن آلة الطحن عن طريق إضافة النيتروجين السائل. ثم إضافة شرائح الغضروف الlyophilized وطحن العينة في سرعتها مسبقا لبضع ثوان تصل إلى دقيقة. تأكد من أن جميع الجسيمات هي الأرض وأنه لا توجد جزيئات البقاء في الجزء السفلي من حجرة طحن.
وأخيراً، اتبع مع تقنية إزالة الخلايا الموصوفة في بروتوكول النص المصاحب قبل تشكيل السقالات. نقل جزيئات الغضاريف مع تسمية صغيرة إلى قالب بلاستيكي أسطواني. اضغط على كل من فقاعات الهواء لتجنب تجاويف في سقالة وملء القالب تماما.
لتجنب تجاويف في السقالات، تأكد من أن يتم الضغط على فقاعات الهواء في حين ملء القالب مع جزيئات الغضاريف. بعد تشكيل، وتجميد القالب لمدة 10 دقائق في ناقص 20 درجة مئوية. ثم lyophilize السقالات الغضروف داخل القالب لمدة 24 ساعة في مجفف تجميد.
بعد التجميل، وإزالة بعناية سقالة من القالب. ضع السقالة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية الطول الموجي 365 نانومتر وعبر وصلة بين عشية وضحاها. شكل أقراص سقالة عن طريق قطع السقالات المعقمة إلى شرائح سميكة ثلاثة ملليمتر.
ثم نقل السقالات إلى آبار منفصلة من لوحة ستة بئر. إضافة ملليلتر واحد من التوسع Chondrocyte المتوسطة على رأس السقالات والسماح لهم لإعادة الترطيب لمدة 30 دقيقة. في حين أن السقالات تُعاد هيدرات، أعد الخلايا والماصات 50 ميكرولتر من تعليق الخلية المعدة فوق سقالة منقوعة قبل.
ثم احتضان سقالة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. عند استخدام chondrocytes، تأكد من أنها لم يتم توسيع الماضي مرور الأول من أجل تقليل عدد الخلايا المتمايزة. بعد ساعة واحدة، والعودة لوحة إلى غطاء محرك السيارة الثقافة وتحويل بعناية على سقالة.
الماصات المتبقية 50 ميكرولترات من تعليق الخلية على سقالة واحتضان لمدة ساعة أخرى في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، إضافة ثلاثة ملليلتر من المتوسط إلى الآبار مع السقالات. تجنب الأنابيب المتوسطة مباشرة على السقالات والتعامل مع لوحة الثقافة بلطف لتجنب انفصال الخلايا.
إعادة لوحة إلى الحاضنة وخلية الثقافة تنازلت السقالات في 37 درجة مئوية. وقد استخدمت مزيج من التلطيخ historlogical والحمض النووي الكم لإظهار أن الأساليب المقدمة في هذه المقالة يؤدي إلى إزالة الخلية كافية سقالة الغضاريف. تم العثور على السقالات الناتجة لا تحتوي على خلايا جنبا إلى جنب مع مستويات غير قابلة للكشف من الحمض النووي.
كما أنها تفتقر إلى الجليكوسامينوغلوليكانس وغنية بالكولاجين II.Here ، ويلاحظ تشكيل المصفوفة الجديدة على سقالة تنازلت مع الخلايا الجذعية ميسينيمال التي كانت مزرع لمدة أربعة أسابيع. تشكيل الجليكوسامينوغلويكان وفيرة بعد أربعة أسابيع. بعد محاولة هذا الإجراء، من المهم فحص ما إذا كان تم إزالة الخلية بنجاح، قبل استخدامه في أي تطبيق.
بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل كيميائي حيوي إضافي مثل محلل البقعة الغربية من أجل الإجابة على أسئلة محددة حول وجود مكونات أخرى مثل عوامل النمو. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال هندسة الأنسجة لاستكشاف استراتيجيات لتجديد الغضاريف باستخدام الأنسجة غير الخلوية من المصادر الالية والسينيجينية. الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات ينبغي دائما أن تتخذ.
