يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجال الاستقلاب المناعي حول مساهمة الخلايا المناعية في الالتهاب الناجم عن السمنة في الدهنية والتهاب الكبد في الأنسجة الكبدية. وقد تم تحسين هذه التقنيات لعزل الخلايا المناعية الدهنية والكبد في نموذج من النظام الغذائي الناجم عن التهاب الكبد الدهني غير الكحولية التي تحققت من خلال غير محددة غير مسببات الأمراض اسكن القوارض. هذه الأساليب يمكن أن تساعد على تعميق فهمنا للآليات المناعية المشاركة في الحفاظ على التوازن الأيضي.
عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه التقنية النضال مع تعظيم العائد من الخلايا المنفصلة قابلة للحياة وظيفيا وإعداد الغات السليم في تدفق cytometry. لتوليد تعليق الأنسجة الدهنية وحيدة الخلية، رش الصدر من الماوس القتل الرحيم مع 70٪ الإيثانول، وجعل بعناية شق مركزي من خمسة إلى ستة سنتيمترات من خلال شق البطن وجدار البطن على طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي والقلب. باستخدام إبرة قياس 26، حقن ما لا يقل عن 10 ملليلتر من محلول ملحي 0.9٪في قمة البطين الأيسر، واستخدام مقص لفتح تجويف البريتوني.
ثم، تشريح الأنسجة الدهنية epigonadal، ووزنها. تفكيك الأنسجة الدهنية ميكانيكيا إلى قطع غرامة في طبق بيتري في أربع درجات مئوية قبل نقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. شطف طبق بيتري مع ملليلتر واحد من 0.5٪ الألبومين مصل البقر، أو BSA، في برنامج تلفزيوني، وإضافة ثلاثة ملليلتر من محلول هضم الأنسجة الدهنية الطازجة المعدة في غرام من الأنسجة الدهنية إلى الأنبوب.
بعد 20 دقيقة في 37 درجة مئوية و 200 التناوب في الدقيقة الواحدة، إضافة خمسة ملليلتر من 0.5٪ BSA في برنامج تلفزيوني، ووضع هضم الدهنية على الجليد. قم بتكفير الحل عدة مرات باستخدام ماصة مصلية 10 ملليلتر، واستخدم المكبس لتمرير الحل من خلال مصفّط 100 ميكرومتر. فصل كسور الأنسجة عن طريق الطرد المركزي، واستخدام ماصة لتجاهل الكسر الدهني العائم.
Resuspend خلية كسر الأوعية الدموية stromal بيليه في ملليلتر واحد من الأمونيوم- كلوريد البوتاسيوم، أو ACK، تحلل العازلة، ووقف تفاعل تحلل مع 10 ملليلتر من مصل عجل الجنين 2٪، أو FCS، في برنامج تلفزيوني بعد بضع ثوان. ثم، وجمع خلايا الدم البيضاء المعزولة عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في 250 ميكرولترات من 2٪ FCS في برنامج تلفزيوني للعد. حصاد الكبد في أنبوب مخروطي من برنامج تلفزيوني على الجليد قبل استخدام الطوابع حقنة لتكفير الأنسجة ميكانيكيا في طبق بيتري في أربع درجات مئوية.
نقل شظايا أنسجة الكبد تشريح في أنبوب 50 ملليلتر تحتوي على 10 ملليلتر من محلول هضم الكبد الدافئ، وشطف طبق بيتري مع ثلاثة ملليلتر من محلول هضم الكبد الطازج. بعد 20 دقيقة في 37 درجة مئوية و 200 دوران في الدقيقة الواحدة، ووقف الهضم مع 20 ملليلتر من HBSS، triturate الطين الأنسجة عدة مرات مع ماصة المصلية 10 ملليلتر. استخدام المكبس لتمرير حل الأنسجة من خلال مصفاة 100 ميكرومتر، وجمع خلايا الكبد عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend بيليه في 20 ملليلتر من HBSS الطازجة، وإزالة مصفوفة الكبد عن طريق الطرد المركزي. جمع عظمى للطرد المركزي، resuspending بيليه في 10 ملليلتر من 33٪ منخفضة الكثافة اللزوجة حل متوسط التدرج في HBSS. فصل خلايا الكبد المناعية بالانفصال الانحداري الكثافة، وإعادة تعليق الكريات البيض في ملليلتر واحد من ACK العازلة.
بعد أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووقف التحلل مع 10 ملليلتر من HBSS، وتصفية الخلايا من خلال مصفاة المسام 30 ميكرومتر في أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي. ثم، resuspend بيليه في 250 microliters من 2٪ FCS في برنامج تلفزيوني للعد. لتحليل تدفق الخلايا للخلايا من السكان الكريات البيض المعزولة، إضافة ما يصل إلى ثلاثة أضعاف 10 الخلايا الست في 100 ميكرولترات من 2٪ FCS في PBS من الأنسجة ذات الاهتمام في فرز الخلايا الفلورية المنشطة البوليسترين الفردية، أو FACS، أنابيب.
إضافة 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة CD16/CD32 إلى كل أنبوب لمنع أي ربط غير محددة لمدة 10 دقائق على الجليد، تليها تلطيخ مع حجم مناسب من خليط الأجسام المضادة وميكر واحد من صبغة قابلة للحياة لكل عينة للسماح التمييز الخلايا الحية والمميتة. بعد 20 دقيقة في أربع درجات مئوية محمية من الضوء، وغسل العينات مرتين مع ملليلتر اثنين من 2٪ FCS بالإضافة إلى برنامج تلفزيوني لكل غسل، والطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم، resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FCS.
لتحليل الخلايا بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة، استخدم عينة تحكم سالبة غير ملوثة لتعيين التشتت الجانبي والواقع للأمام، وضبط الفولتية لمقياس التدفق للكشف عن مجموعة الكريات البيض القابلة للحياة واستبعاد الحطام. المقبل، تشغيل عينات واحدة التحكم الملون للتعويض متعدد الألوان قبل تشغيل العينات التجريبية، وجمع ما لا يقل عن خمس مرات 10 إلى الأحداث الأربعة لكل أنبوب. ثم، تصدير ملفات البيانات FCS للتحليل، وتعيين استراتيجية الغات لC45-إيجابية الكريات البيض للسماح بتحديد مجموعات الخلايا المناعية اللاحقة من الفائدة.
هنا، تظهر استراتيجية تمثيلية لغايات البوابات الفرعية للخلايا T بما في ذلك التمييز المزدوج وتلطيخ الجدوى في دهون المورين بيريغو نادال. CD45-إيجابية الكريات البيض هي الأولى بوابات لD4 و CD8 وبعد ذلك لD44 و CD62 ليغاند للتمييز بين السذاجة والذاكرة المركزية، والذاكرة effector، والخلايا T effector. ثم تتميز الخلايا إيجابية CD44 كذلك مع CD127, القاتل lectin الخلية مستقبلات G1, ومبرمج الموت-1.
هنا ، يتم عرض استراتيجية البوابات لتحليل الخلايا B ، الحبيبات ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، الضامة ، والخلايا التشعبية. يمكن الكشف عن نسبة أعلى من ذاكرة التأثير CD4 إيجابية وCD8 إيجابية الخلايا في الفئران النظام الغذائي عالية الدهون الموجودة في ظروف غير SPF، في حين أن الخلايا التائية CD4 إيجابية وD8-إيجابية CD8 وجدت أن تكون أقل بكثير في هذه الحيوانات مقارنة بفئران النظام الغذائي SPF عالية الدهون في الأسبوع السابع. steatosis شديدة، بما في ذلك زيادة قطرات الدهون الكبيرة مما أدى إلى الستيراتوس الماكروبير، التهاب فيلي، بالونات الكبدية، وتدمير بنية الفصية وجدت في الفئران المكشوفة النظام الغذائي عالية الدهون في حين أن بعض الفئران SPF فقط عرض تراكم الدهون خفيفة في الكبد.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن النسبة المئوية للخلايا القاتلة الطبيعية أعلى في الأنسجة الدهنية في النظام الغذائي عالي الدهون التي تتعرض للفئران ، في حين أظهرت الفئران SPF ذات النظام الغذائي عالي الدهون نسبًا أعلى من الخلايا التشعبية. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم للحفاظ على الخلايا على الجليد وفي الظلام ما لم يذكر خلاف ذلك. يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية إعداد التعليقات خلية واحدة بشكل صحيح وكيفية عزل مورين الدهنية والأنسجة الكبدية لتجارب تدفق الخلايا.
