يساعد هذا البروتوكول على تبسيط قياسات الرسوم الكهربائية أو ERGs في حمار وحشي يرقات مما يوفر قراءة وظيفية هامة للتنمية البصرية ونماذج الأمراض الوراثية. نصائح الإسفنج الناعمة لتسجيل الأقطاب الكهربائية المستخدمة في هذا البروتوكول من السهل تصنيعها باستخدام المواد الاقتصادية والمتاحة بسهولة وتجنب الأضرار المحتملة للعيون اليرقات. يمكن أن يسهل القطب الإسفنجي الأكثر ليونة قياسات ERG المتكررة للعين نفسها.
قد يجد الأفراد الجدد لهذا الإجراء صعوبة في العمل تحت الإضاءة الحمراء الخافتة المستخدمة طوال العملية. ولكن من المهم الحفاظ على التكيف المظلم. لإعداد قطب تسجيل الإسفنج على شكل مخروط ، قم بقطع النهاية من امتداد الرصاص القطب البلاتيني واستخدام مشرط لإزالة 10 ملليمترات من طلاء العزل الخارجي للبوليتيترافلورو إيثيلين من النهاية الجديدة للتمديد.
قطع قطعة 40 ملليمتر من 0.3 ملليمتر قطرها الأسلاك الفضية وربط السلك الفضي مع الأسلاك الداخلية المكشوفة لإرفاق السلك بأمان إلى الرصاص القطب. اغلف المفصل بشريط عازل تاركاً طول 15 ملليمتر من السلك الفضي مكشوفاً. توصيل سلك آخر إلى الطرفية السلبية للبطارية وتزج الطرف الآخر من السلك في المالحة.
غمر السلك الفضي المكشوف في محلول ملحي عادي وتوصيل الطرف الآخر إلى الطرف الموجب لمصدر تيار مباشر من فولت تسعة. بعد 60 ثانية، ضع السلك على الأنسجة الماصة لتجف. في غضون ذلك، قطع 20 في 20 ملليمتر مربع من الاسفنج خلات البولي فينيل في شكل مخروط وتشبع الاسفنج في وقت واحد العازلة رينجر.
تحت مجهر خفيف مع شريط مقياس على العدسة، استخدم شفرة مشرط لتشكيل قمة المخروط إلى ما يقرب من 40 ميكرومتر القطر. الهواء الجافة الإسفنج مخروط على شكل ورقة الأنسجة الماصة حتى أنها صلبة. قبل إدخال السلك الفضي في الإسفنج المخروط المخروط المجفف على شكل خلات البولي فينيل من خلال قاعدة المخروط ، وذلك باستخدام شريط القناع لعزل أي معدن مكشوف زائد للحد من التحف الضوئية.
في يوم التجربة، غمر القطب الإسفنجي في المخزن المؤقت لرينجر لمدة 15 دقيقة لتشبع الإسفنجة بالكامل. قبل ثماني ساعات على الأقل من التسجيلات ، لا تضع أكثر من 20 يرقة حمار وحشي في أنبوب واحد 15 ملليلتر بدون غطاء وملفوفة في رقائق الألومنيوم في حاضنة مظلمة. في نهاية الحضانة، صب حمار وحشي داكن تكييفها في طبق بتري تحت الإضاءة الحمراء الخافتة من الصمام الثنائي الباعث للضوء.
لإعداد منصة الإسفنج، وقطع قطعة من الإسفنج خلات البولي فينيل يساوي تقريبا في سمك إلى عمق طبق بتري 35 ملليمتر بحيث الإسفنج سوف تناسب بشكل مريح داخل الطبق. جعل قطع صغيرة عموديا من خلال نهاية واحدة من الاسفنج لاستيعاب السلك الفضي من القطب المرجعي ونقع الاسفنج في المخزن المؤقت لرينجر السمك الذهبي حتى مشبعة الاسفنج. ثم ضع الاسفنج في طبق بتري نظيف 35 ملليمتر واستخدم منشفة ورقية لامتصاص السائل الزائد حتى لا ينضح أي حل من الاسفنج استجابة لضغطة الاصبع الخفيفة.
لوضع الحيوان للتجربة ، استخدم ماصة باستور ثلاثة ملليمترات لنقل يرقة تخدير على ثلاثة في ثلاثة سنتيمترات مربعة من المنشفة الورقية واستخدام ملقط لوضع المربع على الإسفنج الرطب. باستخدام فرشاة دقيقة غارقة في المخزن المؤقت لرينجر ، قم بضبط موضع اليرقة مع وجود عين واحدة تواجه صعودًا وبعيدًا عن أي سائل على المنشفة تحت اليرقة. اصقل جسم اليرقات بجل العين المرطب للحفاظ على رطوبة الحيوان طوال تسجيل الرسم الكهربائي.
ووضع الطبق على منصة صغيرة ساخنة بالماء أمام حافز ضوء وعاء غانزفيلد الموجود داخل قفص فاراداي. أدخل القطب المرجعي في القطع المصنوع في الإسفنج المنصة. وربط قطب أرضي تم الحصول عليه تجارياً بقفص فاراداي.
إرفاق القطب تسجيل إلى حامل القطب وتأمين حامل إلى ذراع stereotaxic من ميكرومانيبولاتور. باستخدام ماصة باستور ثلاثة ملليمترات، إعادة التشبع غيض من الاسفنج من القطب مع قطرة واحدة من الحل رينجر ووضع المجهر في قفص فاراداي على منصة electroretinogram. استخدام غيض من نسيج ماصة لإزالة أي سائل الزائدة من طرف الاسفنج القطب وتحت المجهر، ووضع القطب النشط بحيث تلميح الاسفنج يمس بلطف سطح القرنية المركزية للعين اليرقات حمار وحشي.
ثم حرك وعاء Ganzfeld نحو منصة الإسفنج مع الحرص على أن اليرقة مغطاة بالوعاء وإغلاق القفص للحد من الضوضاء الكهرومغناطيسية الدخيلة. تزداد حساسية شبكية العين اليرقات الحمار الوحشي إلى ومضات باهتة مع التقدم في السن. بما أن الموجات a-و b لا يمكن التعرف عليها عند كثافة أقل من سالب 1.61 log candela second لكل متر مربع في أربعة أيام بعد الإخصاب بينما يمكن اكتشاف إشارات واضحة عند هذه الكثافة في اليرقات القديمة.
وتزداد سعة الموجات ب زيادة ملحوظة بين أربعة وخمسة بعد الإخصاب. في سبعة أيام، إشارة في 2.48 سجل كانديلا الثانية لكل متر مربع أكبر مقارنة مع الأيام خمسة وستة بعد الإخصاب. A-وb-موجة مرات الضمنية تصبح أسرع بكثير بعد خمسة أيام بعد الإخصاب.
مع عموما, هذه النتائج التي تثبت النضج في وظيفة شبكية العين حمار وحشي بين أربعة إلى سبعة أيام بعد الإخصاب. لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح من الأهمية بمكان أن الإسفنج مشبعة تماما مع السوائل التي تساعد على الحفاظ على الموصلية من القطب تسجيل وخفض مستويات الضوضاء. إذا كانت الموجة ذات أهمية خاصة ، يمكن تطبيق العلاجات الدوائية لمنع مكون الموجة B وبالتالي تعريض الموجة الكاملة.
