Este protocolo ajuda a simplificar as medidas de eletroretinogramas ou ERGs em zebrafish larval que fornece uma leitura funcional importante do desenvolvimento visual e modelos de doenças genéticas. As pontas de esponja macia de gravação de eletrodos usados neste protocolo são fáceis de fabricar usando materiais econômicos e prontamente disponíveis e evita danos potenciais aos olhos larvais. O eletrodo mais macio com ponta de esponja pode facilitar repetidas medições de ERG do mesmo olho.
Indivíduos novos neste procedimento podem achar difícil trabalhar sob a iluminação vermelha fraca que é usada durante todo o procedimento. Mas é importante que a adaptação sombria seja mantida. Para preparar o eletrodo de gravação de esponja em forma de cone, corte a extremidade de uma extensão de chumbo eletrodo de platina e use um bisturi para remover 10 milímetros do revestimento de isolamento de politetrafluoroetileno externo da nova extremidade da extensão.
Corte um pedaço de 40 milímetros de um fio de prata de 0,3 milímetros de diâmetro e entrelaça o fio de prata com o fio interno exposto para fixar o fio com segurança ao chumbo do eletrodo. Encarnar a junta com fita isolante deixando um comprimento de aproximadamente 15 milímetros de fio de prata exposto. Conecte outro fio ao terminal negativo da bateria e mergulhe a outra extremidade do fio no soro fisiológico.
Mergulhe o fio de prata exposto em soro fisiológico normal e conecte a outra extremidade ao terminal positivo de uma fonte de corrente direta de nove volts. Após 60 segundos, coloque o fio no tecido absorvente para secar. Enquanto isso, corte um quadrado de 20 por 20 milímetros de esponja de acetato de polivinyl em uma forma de cone e saturar a esponja em uma vez tampão de Ringer.
Sob um microscópio leve com uma barra de escala na ocular, use uma lâmina de bisturi para moldar o ápice do cone a aproximadamente 40 micrômetros de diâmetro. Seque o ar da esponja em forma de cone em papel de tecido absorvente até ficar sólido. Antes de inserir o fio de prata na esponja de acetato de polivinil em forma de cone sólido seco através da base do cone, usando fita adesiva para isolar qualquer excesso de metal exposto para reduzir artefatos fotovoltaicos.
No dia do experimento, mergulhe o eletrodo de ponta esponja no tampão de Ringer por 15 minutos para saturar totalmente a esponja. Pelo menos oito horas antes das gravações, coloque não mais do que 20 larvas de zebrafish em um único tubo de 15 mililitros sem tampa e envolto em papel alumínio em uma incubadora escura. No final da incubação, despeje o zebrafish adaptado à escuridão em uma placa de petri sob iluminação vermelha fraca de um diodo emissor de luz.
Para preparar a plataforma de esponja, corte um pedaço de esponja de acetato de polivinyl aproximadamente igual em espessura à profundidade de uma placa de petri de 35 milímetros para que a esponja se encaixe perfeitamente dentro da placa. Faça um pequeno corte verticalmente através de uma extremidade da esponja para acomodar o fio de prata do eletrodo de referência e mergulhe a esponja no tampão de Ringer de peixe dourado até que a esponja esteja saturada. Em seguida, coloque a esponja em uma placa de petri de 35 milímetros limpa e use uma toalha de papel para absorver o líquido extra até que nenhuma solução exale da esponja em resposta a uma prensa de dedo leve.
Para posicionar o animal para o experimento, use uma pipeta Pasteur de três milímetros para transferir uma larva anestesiada para um quadrado de três por três centímetros de papel toalha e use fórceps para colocar o quadrado na esponja umedeçada. Usando uma escova fina encharcada no tampão de Ringer, ajuste a posição da larva com um olho voltado para cima e para longe de qualquer líquido na toalha sob a larva. Esmalte o corpo larval com gel ocular hidratante para manter o animal hidratado durante toda a gravação do eletroretinograma.
E coloque o prato em uma pequena plataforma aquecida à água em frente ao estímulo leve da tigela ganzfeld situado dentro de uma gaiola faraday. Insira o eletrodo de referência no corte feito na esponja da plataforma. E conectar um eletrodo terrestre obtido comercialmente à jaula de Faraday.
Conecte o eletrodo de gravação a um suporte de eletrodo e fixe o suporte no braço estereotipado de um micromanipulador. Usando uma pipeta Pasteur de três milímetros, ressaturar a ponta da esponja do eletrodo com uma gota da solução de Ringer e posicionar o microscópio na gaiola de Faraday sobre a plataforma de eletroretinograma. Use a ponta de um tecido absorvente para remover qualquer excesso de líquido da ponta da esponja de eletrodo e sob o microscópio, posicione o eletrodo ativo para que a ponta da esponja toque suavemente a superfície córnea central do olho de zebrafish larval.
Em seguida, mova a tigela ganzfeld em direção à plataforma de esponja tomando cuidado para que a larva esteja coberta pela tigela e feche a gaiola para reduzir o ruído eletromagnético estranho. A sensibilidade da retina de zebrafish larval para dimmer pisca com a idade. Como as ondas a e b não são reconhecíveis em intensidades inferiores a menos 1,61 log candela segundo por metro quadrado a quatro dias após a fertilização, enquanto sinais claros são detectáveis nessas intensidades nas larvas mais antigas.
A amplitude da onda B aumenta significativamente entre quatro e cinco pós-fertilização. Aos sete dias, o sinal a 2,48 log candela segundo por metro quadrado é maior em comparação com os dias cinco e seis pós-fertilização. Os tempos implícitos de ondas A e B tornam-se significativamente mais rápidos após cinco dias após a fertilização.
No geral, esses resultados demonstram um amadurecimento na função de retina de zebrafish entre quatro a sete dias após a fertilização. Para executar com sucesso este protocolo é fundamental que as esponjas estejam totalmente saturadas com fluido, o que ajuda a manter a condutividade do eletrodo de gravação e reduz os níveis de ruído. Se a onda a for de interesse particular, tratamentos farmacológicos podem ser aplicados para bloquear o componente de onda B, expondo assim a onda A completa.
