Dieses Protokoll vereinfacht die Messung von Elektroretinogrammen oder ERGs bei Larvenzebrafischen, was eine wichtige funktionelle Auslesung von visuellen Entwicklungs- und genetischen Krankheitsmodellen bietet. Die weichen Schwammspitzen der Erfassung von Elektroden, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind einfach mit wirtschaftlichen und leicht verfügbaren Materialien herzustellen und vermeiden mögliche Schäden an den Larvenaugen. Die weichere Schwamm-Mikrode kann wiederholte ERG-Messungen desselben Auges ermöglichen.
Personen, die neu in diesem Verfahren finden kann es schwierig, unter der dim roten Beleuchtung zu arbeiten, die während des gesamten Verfahrens verwendet wird. Aber es ist wichtig, dass die dunkle Anpassung beibehalten wird. Zur Vorbereitung der kegelförmigen Schwammaufnahmeelektrode schneiden Sie das Ende aus einer Platinelektroden-Bleiverlängerung und entfernen Sie mit einem Skalpell 10 Millimeter der äußeren Polytetrafluorethylen-Isolierbeschichtung vom neuen Ende der Verlängerung.
Schneiden Sie einen 40 Millimeter großen Silberdraht mit einem Durchmesser von 0,3 Millimetern und verschließen Sie den Silberdraht mit dem freiliegenden Innendraht, um den Draht sicher an der Elektrodenleitung zu befestigen. Umhüllen Sie das Gelenk mit Isolierband und lassen Sie eine ca. 15 Millimeter lange Silberdrahtmenge freigelegt. Schließen Sie einen weiteren Draht an die negative Klemme der Batterie an und tauchen Sie das andere Ende des Drahtes in die Saline ein.
Tauchen Sie den freiliegenden Silberdraht in normale Saline ein und verbinden Sie das andere Ende mit der positiven Klemme einer Gleichstromquelle von neun Volt. Legen Sie den Draht nach 60 Sekunden zum Trocknen auf absorbierendes Gewebe. In der Zwischenzeit ein 20 mal 20 Millimeter großes Quadrat Polyvinylacetatschwamm in eine Kegelform schneiden und den Schwamm einmal ringers Puffer sättigen.
Unter einem Lichtmikroskop mit einer Skalenstange auf dem Okular, verwenden Sie eine Skalpellklinge, um die Spitze des Kegels auf einen Durchmesser von etwa 40 Mikrometern zu formen. Den kegelförmigen Schwamm auf saugfähigem Gewebepapier lufttrocknen, bis er fest ist. Vor dem Einsetzen des Silberdrahtes in den getrockneten massiven kegelförmigen Polyvinylacetatschwamm durch die Basis des Kegels, mit Maskenband, um überschüssiges exponiertes Metall zu isolieren, um Photovoltaik-Artefakte zu reduzieren.
Tauchen Sie am Tag des Experiments die schwammige Elektrode für 15 Minuten in Ringers Puffer ein, um den Schwamm vollständig zu sättigen. Mindestens acht Stunden vor den Aufnahmen nicht mehr als 20 Zebrafischlarven in einem einzigen 15-Milliliter-Rohr ohne Deckel und in Aluminiumfolie eingewickelt in einen dunklen Inkubator legen. Am Ende der Brutzeit gießen Sie den dunkel angepassten Zebrafisch unter dunkelroter Beleuchtung aus einer Leuchtdiode in eine Petrischale.
Um die Schwammplattform vorzubereiten, schneiden Sie ein Stück Polyvinylacetatschwamm etwa gleich dick wie die Tiefe einer 35 Millimeter Petrischale, so dass der Schwamm eng in die Schale passt. Machen Sie einen kleinen Schnitt vertikal durch ein Ende des Schwamms, um den Silberdraht der Referenzelektrode aufzunehmen und den Schwamm in Goldfisch Ringers Puffer einweichen, bis der Schwamm gesättigt ist. Legen Sie den Schwamm dann in eine saubere 35-Millimeter-Petrischale und verwenden Sie ein Papiertuch, um die zusätzliche Flüssigkeit zu absorbieren, bis keine Lösung aus dem Schwamm als Reaktion auf einen leichten Fingerdruck ausstrahlt.
Um das Tier für das Experiment zu positionieren, verwenden Sie eine drei Millimeter Pasteur Pipette, um eine anästhesierte Larve auf eine drei mal drei Zentimeter große Quadratfläche Papiertuch zu übertragen und das Quadrat mit Zangen auf den befeuchteten Schwamm zu legen. Passen Sie mit einer feinen Bürste, die in Ringers Puffer eingeweicht ist, die Position der Larve mit einem Auge nach oben und weg von jeder Flüssigkeit auf dem Handtuch unter der Larve ein. Glasieren Sie den Larvenkörper mit feuchtigkeitsspendendem Augengel, um das Tier während der gesamten Elektroretinogrammaufnahme hydratisiert zu halten.
Und legen Sie das Gericht auf eine kleine, wasserbeheizte Plattform vor der Ganzfeld-Schüssel Lichtreiz in einem Faraday Käfig. Setzen Sie die Referenzelektrode in den Schnitt des Plattformschwamms ein. Und verbinden Sie eine kommerziell hergestellte Bodenelektrode mit dem Faraday Käfig.
Befestigen Sie die Aufnahmeelektrode an einem Elektrodenhalter und befestigen Sie den Halter am stereotaxic Arm eines Mikromanipulators. Mit einer drei Millimeter Pasteur-Pipette die Schwammspitze der Elektrode mit einem Tropfen Ringer-Lösung wieder sättigen und das Mikroskop im Faraday-Käfig über die Elektroretinogramm-Plattform positionieren. Verwenden Sie die Spitze eines absorbierenden Gewebes, um überschüssige Flüssigkeit aus der Elektrodenschwammspitze zu entfernen und unter dem Mikroskop, positionieren Sie die aktive Elektrode, so dass die Schwammspitze sanft die zentrale Hornhautoberfläche des Larvenzebrafischauges berührt.
Dann bewegen Sie die Ganzfeld-Schüssel in Richtung der Schwammplattform, um darauf zu achten, dass die Larve von der Schüssel bedeckt wird, und schließen Sie den Käfig, um fremde elektromagnetische Geräusche zu reduzieren. Die Empfindlichkeit der Larvenzebrafisch Netzhaut zu Dimmer blinkt mit dem Alter zu. Da die A- und B-Wellen bei Intensitäten von weniger als minus 1,61 Log-Candela-Sekunde pro Meter nach der Befruchtung nicht erkennbar sind, sind bei diesen Intensitäten in den älteren Larven klare Signale nachweisbar.
Die B-Wellen-Amplitude nimmt deutlich zwischen vier und fünf nach der Befruchtung zu. Nach sieben Tagen ist das Signal bei 2,48 Log Candela Sekunde pro Quadratmeter größer als an den Tagen fünf und sechs nach der Befruchtung. A- und B-Wellen-implizite Zeiten werden nach fünf Tagen nach der Befruchtung deutlich schneller.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse eine Reifung in der Netzhautfunktion von Zebrafischen zwischen vier und sieben Tagen nach der Befruchtung. Um dieses Protokoll erfolgreich durchführen zu können, ist es wichtig, dass Schwämme vollständig mit Flüssigkeit gesättigt sind, was dazu beiträgt, die Leitfähigkeit der Aufnahmeelektrode aufrechtzuerhalten und den Geräuschpegel senkt. Wenn die a-Welle von besonderem Interesse ist, können pharmakologische Behandlungen angewendet werden, um die B-Wellenkomponente zu blockieren und so die volle a-Welle freizulegen.
