Este protocolo ayuda a simplificar las mediciones de electrorretinogramas o ERE en peces cebra larvales que proporciona una importante lectura funcional del desarrollo visual y modelos de enfermedades genéticas. Las puntas de esponja suave de los electrodos de grabación utilizados en este protocolo son fáciles de fabricar utilizando materiales económicos y fácilmente disponibles y evitan posibles daños a los ojos larvarios. El electrodo con punta de esponja más suave puede facilitar las mediciones repetidas de ERG del mismo ojo.
Individuos nuevos en este procedimiento pueden encontrar difícil trabajar bajo la iluminación roja tenue que se utiliza durante todo el procedimiento. Pero es importante que se mantenga la adaptación oscura. Para preparar el electrodo de grabación de esponja en forma de cono, corte el extremo de una extensión de cable de electrodo de platino y utilice un bisturí para eliminar 10 milímetros del recubrimiento exterior de aislamiento de politetrafluoroetileno del nuevo extremo de la extensión.
Corte una pieza de 40 milímetros de un alambre plateado de 0,3 milímetros de diámetro y encoja el alambre de plata con el cable interno expuesto para fijar de forma segura el cable al cable del electrodo. Encierra la junta con cinta aislante dejando una longitud de aproximadamente 15 milímetros de alambre de plata expuesta. Conecte otro cable al terminal negativo de la batería y sumerja el otro extremo del cable en la solución salina.
Sumerja el alambre de plata expuesto en solución salina normal y conecte el otro extremo al terminal positivo de una fuente de corriente directa de nueve voltios. Después de 60 segundos, coloque el cable sobre el tejido absorbente para secar. Mientras tanto, corta una esponja de acetato de polivinilo de 20 por 20 milímetros en forma de cono y satura la esponja en una sola vez tampón de Ringer.
Bajo un microscopio de luz con una barra de escala en el ocular, utilice una hoja de bisturí para dar forma al ápice del cono a un diámetro de aproximadamente 40 micrómetros. Seque al aire la esponja en forma de cono en papel de tejido absorbente hasta que sea sólida. Antes de insertar el alambre de plata en la esponja de acetato de polivinilo en forma de cono sólido seco a través de la base del cono, utilizando cinta adhesiva para aislar cualquier exceso de metal expuesto para reducir los artefactos fotovoltaicos.
El día del experimento, sumerja el electrodo con punta de esponja en el tampón de Ringer durante 15 minutos para saturar completamente la esponja. Al menos ocho horas antes de las grabaciones, coloque no más de 20 larvas de pez cebra en un solo tubo de 15 mililitros sin tapa y envuelto en papel de aluminio en una incubadora oscura. Al final de la incubación, verter el pez cebra adaptado a la oscuridad en un plato de petri bajo la iluminación roja tenue de un diodo emisor de luz.
Para preparar la plataforma de esponja, corte un trozo de esponja de acetato de polivinilo aproximadamente igual en grosor a la profundidad de un plato de petri de 35 milímetros para que la esponja se ajuste perfectamente dentro del plato. Haga un pequeño corte verticalmente a través de un extremo de la esponja para acomodar el alambre de plata del electrodo de referencia y empape la esponja en el tampón del pez dorado Ringer hasta que la esponja esté saturada. A continuación, coloque la esponja en un plato limpio de 35 milímetros de petri y use una toalla de papel para absorber el líquido adicional hasta que no exuda ninguna solución de la esponja en respuesta a una prensa ligera de los dedos.
Para posicionar al animal para el experimento, utilice una pipeta Pasteur de tres milímetros para transferir una larva anestesiada a una toalla de papel de tres por tres centímetros y use fórceps para colocar el cuadrado sobre la esponja humedecida. Usando un cepillo fino empapado en el tampón de Ringer, ajuste la posición de la larva con un ojo mirando hacia arriba y lejos de cualquier líquido en la toalla debajo de la larva. Espacute el cuerpo larvario con gel hidratante para los ojos para mantener al animal hidratado durante todo el registro de electrorretinograma.
Y coloque el plato en una pequeña plataforma calentada con agua frente al estímulo ligero del cuenco de Ganzfeld situado dentro de una jaula de Faraday. Inserte el electrodo de referencia en el corte realizado en la esponja de la plataforma. Y conecte un electrodo de tierra obtenido comercialmente a la jaula de Faraday.
Fije el electrodo de grabación a un soporte de electrodo y fije el soporte al brazo estereotaxico de un micromaniprógrafo. Usando una pipeta Pasteur de tres milímetros, resaturar la punta de esponja del electrodo con una gota de la solución de Ringer y colocar el microscopio en la jaula de Faraday sobre la plataforma de electroretinograma. Utilice la punta de un tejido absorbente para eliminar cualquier exceso de líquido de la punta de esponja del electrodo y debajo del microscopio, coloque el electrodo activo de modo que la punta de la esponja toque suavemente la superficie corneal central del ojo de cebra larval.
A continuación, mueva el tazón de Ganzfeld hacia la plataforma de esponja cuidando que la larva esté cubierta por el tazón y cierre la jaula para reducir el ruido electromagnético extraño. La sensibilidad de la retina del pez cebra larval a los destellos de atenuación aumenta con la edad. Como las ondas a y b no son reconocibles a intensidades inferiores a menos de 1,61 log candela segundo por metro cuadrado a los cuatro días después de la fertilización, mientras que las señales claras son detectables en estas intensidades en las larvas más antiguas.
La amplitud de la onda b aumenta notablemente entre cuatro y cinco después de la fertilización. A los siete días, la señal a 2,48 log candela segundo por metro cuadrado es mayor en comparación con los días cinco y seis después de la fertilización. Los tiempos implícitos de onda A y b se vuelven significativamente más rápidos después de cinco días después de la fertilización.
Con general, estos resultados demuestran una maduración en la función de la retina del pez cebra entre cuatro y siete días después de la fertilización. Para realizar con éxito este protocolo es fundamental que las esponjas estén completamente saturadas de fluido que ayude a mantener la conductividad del electrodo de grabación y reduzca los niveles de ruido. Si la onda a es de particular interés, se pueden aplicar tratamientos farmacológicos para bloquear el componente de onda b, exponiendo así la onda a completa.
