このプロトコルは、視覚発達および遺伝病モデルの重要な機能的読み出しを提供する幼虫ゼブラフィッシュにおける電解図またはERGの測定を簡素化するのに役立ちます。このプロトコルで使用される記録電極の柔らかいスポンジ先端は経済的で容易に利用できる材料を使用して製造し易く、幼虫の目への潜在的な損傷を避ける。柔らかいスポンジチップ電極は同じ目の繰り返しERG測定を容易にすることができる。
この手順に慣れた個人は、手順全体で使用される薄暗い赤色の照明の下で作業するのが難しいかもしれません。しかし、暗い適応が維持されるのが重要です。円錐形のスポンジ記録電極を準備するには、白金電極リードエクステンションから端を切り、メスを使用して延長の新しい端から外側のポリテトラフルオロエチレン断熱コーティングの10ミリメートルを除去します。
直径0.3ミリメートルの銀線40ミリメートルを切り、銀線を露出したインナーワイヤーで巻き取り、電極リードにワイヤーをしっかりと取り付けます。約15ミリメートルの長さの銀線を露出させたまま絶縁テープでジョイントを包みます。別のワイヤーをバッテリーの負の端子に接続し、その他の端を生理線に浸します。
露出した銀線を通常の生理学に浸し、反対側を9ボルト直流電流源の正の端子に接続します。60秒後、吸水組織にワイヤーを置いて乾燥させる。その間、ポリ酢酸ビニルスポンジの20 x 20ミリメートル平方メートルを円錐形に切り、リンゴの緩衝液を1回で飽和させます。
接眼用のスケールバーを持つ軽い顕微鏡の下で、約40マイクロメートルの直径に円錐の頂点を形作るためにメスの刃を使用する。吸着性ティッシュペーパーの上にコーン状のスポンジを固体になるまで空気乾燥させます。乾燥した固体コーン状のポリ酢酸ビニルスポンジに銀線を挿入する前に、マスクテープを使用して余分な露出金属を絶縁して光起電力のアーティファクトを低減する。
実験当日、スポンジ先端電極をリンガーのバッファーに15分間浸し、スポンジを完全に飽和させます。録音の少なくとも8時間前に、蓋なしで15ミリリットルチューブに20匹以下のゼブラフィッシュの幼虫を入れ、暗いインキュベーターでアルミニウム箔で包みます。インキュベーションの最後に、暗く適応したゼブラフィッシュを発光ダイオードから薄暗い赤い照明の下でシャーレに注ぎます。
スポンジプラットフォームを準備するには、ポリ酢酸ビニルスポンジの一部を35ミリメートルのシャーレの深さにほぼ等しい厚さにカットして、スポンジが皿の中にぴったりと収まるようにします。参照電極の銀線を収容するためにスポンジの一方の端を縦に細かく切り、スポンジが飽和するまでスポンジを金魚リンガーのバッファに浸します。その後、スポンジをきれいな35ミリメートルのシャーレに入れ、薄い指のプレスに応答してスポンジから溶液が出なくなるまで余分な液体を吸収するためにペーパータオルを使用します。
実験のために動物を配置するには、3ミリメートルのパスツールピペットを使用して麻酔幼虫を3センチメートル平方のペーパータオルに移し、鉗子を使用して湿らせたスポンジの上に正方形を置きます。リンガーのバッファーに浸した細かいブラシを使用して、片目を上向きにして、幼虫の下のタオルの液体から離れて幼虫の位置を調整します。幼虫の体を保湿眼用ゲルでグレーズし、電気レティノグラム記録全体で動物を水分補給し続けます。
そして、ファラデーケージの中に位置するガンツフェルトボウルライト刺激の前に、小さな水で加熱されたプラットフォームに料理を置きます。リファレンス電極をプラットフォームスポンジで作ったカットに挿入します。そして、市販の接地電極をファラデーケージに接続します。
記録電極を電極ホルダーに取り付け、マイクロマニピュレーターのステレオタックスアームにホルダーを固定します。3ミリメートルのパスツールピペットを使用して、リンガーの溶液の1滴で電極のスポンジ先端を再飽和させ、電極レチノグラムプラットフォーム上のファラデーケージに顕微鏡を配置します。吸収剤組織の先端を使用して、電極スポンジ先端から余分な液体を取り除き、顕微鏡の下で、スポンジ先端が幼虫ゼブラフィッシュの目の中央角膜表面に優しく触れるようにアクティブ電極を配置します。
その後、ガンツフェルトボウルをスポンジプラットフォームに向かって移動させ、幼虫がボウルで覆われていることを考慮し、余分な電磁ノイズを減らすためにケージを閉じます。幼虫ゼブラフィッシュのレチナの調光に対する感受性は、年齢とともに増加する。A波とb波は受精後4日で1メートル当たりマイナス1.61ログカンデラ秒未満の強度では認識できないのに対し、古い幼虫ではこれらの強度で明確な信号が検出可能です。
B波振幅は、受精後4~5回の間で著しく増加する。7日では、1メートル当たり2.48ログカンデラ秒の信号は、受精後5日と6日目に比べて大きくなります。A波とb波の暗黙の時間は受精後5日後に有意に速くなる。
全体的に、これらの結果は、受精後4〜7日間の間にゼブラフィッシュのレチナル機能の成熟を示す。このプロトコルを正常に実行するには、スポンジが完全に液体で飽和し、記録電極の導電性を維持し、ノイズレベルを下げることが重要です。a波が特に関心がある場合、薬理学的治療を適用してB波成分をブロックし、それによって完全なa波を暴露することができる。
