طرقنا الخطوط العريضة طريقة بسيطة وتكرار لدراسة نانوتكسية، مثل دراسة أنواع موت الخلايا وفحص إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا هو شكل صارم يسمح لنا لدراسة السكان الفرعية من الخلايا والأنواع المختلفة المتنامية من موت الخلايا. تسمح لنا طريقة دراسة المسبار DHE باكتشاف وقياس أنواع الأكسجين التفاعلية تليها عملية استئصال البول المتدفقة ، والتصوير المجهري عالي المحتوى ، وتحليل الفلورسينس القائم على الزوجين.
للبدء، ضع أنبوب Eppendorf يحتوي على جسيمات نانوية أكسيد الزنك في محلول مخزون جسيمات نانوية أكسيد الزنك في صوتاتور لمدة 15 دقيقة. إعداد جسيمات نانوية أكسيد الزنك بتركيزات مختلفة باستخدام مخزون نانو جسيمات نانوية من ملليغرام لكل ملليلتر. ثم، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، بذور MRC5 الخلايا الليفية الرئة البشرية على ثلاثة لوحات ثقافة ستة جيدا في تركيز واحد من 10 مرات إلى الخلايا الخامسة في البئر.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. بعد يوم واحد، علاج الخلايا مع مليلتر اثنين من الجسيمات النانوية أكسيد الزنك لمدة ثماني ساعات، 16 ساعة، أو 24 ساعة. في كل نقطة زمنية، قم بجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر، وطاردة مركزية بمعدل 300 مرة ز لمدة خمس دقائق.
غسل الكريات الخلية مرتين مع المالحة الفوسفات المخزنة، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا مع العازلة ربط 1X. المقبل، إضافة خمسة microliters من فيتC الملحق الخامس وصمة عار في خمسة microliters من مادة بوديديوم ايودييد الحمض النووي وصمة عار. احتضان الخلايا الملطخة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
قبل فرز الخلايا عن طريق تدفق cytometry، أعلى حتى العينات مع 400 ميكرولترات إضافية من 1X العازلة ملزمة. جدولة المخطط الشريطي باستخدام كثافة الوسيطة التي تم الحصول عليها. الآن استخدام ماصة لإضافة ملليلتر واحد من الجسيمات النانوية في تركيزات مختلفة في قوارير، تليها تسعة ملليلتر من الغذاء يطير لجعل تركيز النهائي من 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر، 0.25 ملليغرام لكل ملليلتر، أو 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر أكسيد الزنك الجسيمات النانوية.
الماصات صعودا وهبوطا لخلط شامل. السماح للمواد الغذائية التي تحتوي على جسيمات نانوية أكسيد الزنك أن تبرد لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات على الأقل قبل الاستخدام. ثم تخدير ذباب الذكور والإناث البالغين في قارورة مع ثاني أكسيد الكربون ، وإدخال خمسة ذباب ذكر وخمس ذباب أنثى في كل قارورة لمدة خمسة أيام.
السماح لهم بالتزاوج ووضع البيض على سطح الطعام. بعد التخدير ، قم بإزالة الذباب الأبوي والسماح للبيض بالخضوع لمزيد من التطوير في درجة حرارة الغرفة ، والتي تتكون من أربع مراحل نمو مختلفة. مرحلة الجنين واليرقات والجبل والكبار.
بعد 72 إلى 120 ساعة ، يتطور البيض الطازج إلى يرقات متأخرة ثالثة. باستخدام ملقط، وجمع اليرقات من جدار القنينات لتحليلها. في بئر من طبق تشريح مع تشريح المتوسطة أو برنامج تلفزيوني، ووضع اليرقات في الحل.
تحت مجسم مجسم، استخدم طرف ملقط لجعل ثقب صغير، وكسر فتح طبقة بشرة من اليرقات. سحب بعناية من القناة الهضمية. وضع القناة الهضمية في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر التي تحتوي على شنايدر Drosophila المتوسطة.
أضف ميكرولتر واحد من مسبار DHE، واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اغسل الأمعاء ثلاث مرات باستخدام وسيط شنايدر كل خمس دقائق. جبل القناة الهضمية على الشرائح الزجاجية، وتوريد مع 10 ميكرولترات من antifade تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI.
التقاط الصور تحت المجهر confocal. لقياس الفلور، قم باستيراد الصور المُلتقطة من الفلورنس الملتقطة باستخدام المجهر الفلوري أو المجهري بالليزر في برنامج ImageJ. انقر على قائمة التحليل، وحدد قياسات مجموعة.
حدد مقياس الإخراج، مثل كثافة المنطقة المتكاملة والقيمة الرمادية المتوسط. حدد منطقة بدون فلورانس لتعيين الخلفية. انقر فوق قياس.
قم بتصدير البيانات إلى جدول البيانات، ثم حدد الفلورس الخلية الإجمالية المصححة. إنشاء مخطط شريطي، وإجراء تحليل إحصائي. في هذه الدراسة، تظهر الخلايا المعالجة بالجسيمات النانوية أكسيد الزنك نسبة أعلى من الخلايا R3 أو أحدث الخلايا المبرمجة R6 من الخلايا التحكم R5. تم الإشارة إلى موت الخلايا النخرية بواسطة R4. تم تقسيم الأمعاء المستخرجة من يرقة الدوزوفيليا إلى ثلاثة مجالات منفصلة ذات أصل تنموي مختلف.
أي، في الـ(جبوت) و(ميدغوت) و(هيدغوت) DHE الأسهم يميل إلى انتهاء بسرعة إلى حد ما ، لذلك كن حذرا من حل الأسهم التي تستخدمها. بدلا من ذلك، هل يمكن أن تجرب تحقيقات أخرى، على سبيل المثال خلية روش، الذي تم تصميمه للكشف عن ROS داخل الخلايا في إشارات خضراء، وهذا هو أكثر من photostable DHE.
بروتوكولنا يوفر الخطوط العريضة العامة لدراسة إنتاج ROS داخل الخلايا، وتحديد كمية من مستوى ROS لدراسة سمية النانوكسي. ومن المعروف أن DMSO أن يكون أفضل المذيبات لDHE من برنامج تلفزيوني. ومع ذلك، DMSO سامة.
لذلك ، أود أن أنصح المستخدم بتقييد العملية بأكملها للدراسة إلى 30 دقيقة كحد أقصى. هذا هو لأنك قد تلاحظ نتيجة إيجابية كاذبة كما قد يسبب DMSO موت الخلايا.
