우리의 방법은 세포 사멸의 모형을 검토하고 반응성 산소 종의 생산을 검토하는 것과 같은 나노 독성을 연구하기 위한 간단하고 반복적인 방법을 설명합니다. 형광 활성화 세포 정렬은 우리가 세포의 하위 집단과 세포 죽음의 성장 하는 다른 유형을 연구 할 수 있도록 엄격한 형식. DHE 프로브 연구 방법을 사용하면 반응성 산소 종을 검출하고 정량화한 다음 유동 세포측정, 현미경 고함량 이미징 및 결합 기반 형광 분석을 통해 정량화할 수 있습니다.
우선, 산화 아연 나노 입자를 함유 한 Eppendorf 튜브를 15 분 동안 초음파 처리기에 넣습니다. 밀리리터 산화 아연 나노 입자 스톡당 1밀리그램을 사용하여 다양한 농도에서 산화 아연 나노 입자를 준비합니다. 그런 다음, 생물 안전 캐비닛에서, 종자 MRC5 인간 폐 섬유아세포는 잘 당 다섯 번째 세포에 1회 10의 농도에서 3개의 6웰 배양 판에 섬유아세포.
섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 하루 후, 8 시간, 16 시간 또는 24 시간 동안 산화 아연 나노 입자의 두 밀리리터로 세포를 치료하십시오. 매 번, 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 수집하고 원심분리기는 5분 동안 300배 g로 수집합니다.
인산염 완충식식염으로 세포 펠릿을 두 번 씻은 다음 1X 바인딩 버퍼로 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, FITC 부속서 V 얼룩 5개의 마이크로리터를 프로피듐 요오드 DNA 얼룩 5개마이크로리터에 추가합니다. 어두운 실온에서 스테인드 셀을 15분 동안 배양합니다.
세포순환을 흐름으로 분류하기 전에 1X 결합 버퍼의 400 마이크로리터를 추가로 사용하여 샘플을 위로 올려주세요. 얻은 중앙값 강도를 사용하여 막대 차트를 타부레이트합니다. 이제 파이펫을 사용하여 다른 농도의 나노 입자 1 밀리리터를 바이알에 추가하고, 플라이 푸드의 9 밀리리터가 밀리리터 당 0.1 밀리그램, 밀리리터 당 0.25 밀리그램, 또는 밀리리터 아연 산화탄소 나노 입자당 0.5 밀리그램의 최종 농도를 만듭니다.
파이펫을 위아래로 위아래로 섞어 철저히 섞습니다. 산화 아연 나노 입자가 함유 된 플라이 푸드를 사용하기 전에 적어도 2 ~ 3 시간 동안 식힙니다. 그런 다음 성인 남성과 여성이 이산화탄소를 가진 유리병에서 파리를 마취하고 5 일 동안 각 유리병에 5 개의 수컷 파리와 5 개의 암컷 파리를 소개합니다.
음식 표면에 알을 짝짓고 낳을 수 있습니다. 마취 후, 부모의 파리를 제거하고 네 가지 발달 단계로 구성된 실온에서 추가 개발을 받을 수 있습니다. 배아, 애벌레, 푸팔 및 성인 단계.
72~120시간 후에 갓 낳은 알은 세 번째 인스타 애벌레로 발전합니다. 집게를 사용하여 분석을 위해 바이알 벽에서 애벌레를 수집합니다. 해부 매체 또는 PBS가있는 해부 접시에 애벌레를 용액에 넣습니다.
스테레오 현미경의 밑에, 작은 구멍을 만들기 위하여 집게의 끝을 사용하고, 애벌레의 표피 층을 열어 깰. 조심스럽게 용기를 뽑아. 용기를 슈나이더의 드로소필라 배지가 들어 있는 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 넣습니다.
DHE 프로브의 마이크로리터 1개를 추가하고 실온에서 10분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 슈나이더의 매체를 사용하여 5분마다 3번 간 소화합니다. 용기를 유리 슬라이드에 장착하고 DAPI가 포함된 안티페이드 장착 매체 10마이크로리터를 공급합니다.
공초점 현미경으로 이미지를 캡처합니다. 형광을 측정하기 위해 형광 현미경 검사또는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 을 사용하여 획득한 캡처된 형광 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다. 분석 메뉴를 클릭하고 설정된 측정을 선택합니다.
영역 통합 강도 및 평균 회색 값과 같은 출력 측정값을 선택합니다. 형광이 없는 영역을 선택하여 배경을 설정합니다. 측정값을 클릭합니다.
데이터를 스프레드시트로 내보내고 수정된 총 세포 형광을 결정합니다. 막대 차트를 구성하고 통계 분석을 수행합니다. 이 연구에서는, 산화 아연 나노 입자 처리 된 세포는 제어 세포 R5보다 초기 R3 또는 후기 세포 R6 세포의 높은 비율을 나타낸다. 괴사 세포 죽음은 R4에 의해 표시되었다. 드로소필라 애벌레에서 추출된 내장은 다른 발달 기원의 3개의 개별 도메인으로 나뉘었다.
즉, 전가, 미드구트, 힌드구트. DHE 주식은 다소 빨리 만료되는 경향이 있으므로 사용 중인 스톡 솔루션에 주의하십시오. 또는 녹색 신호에서 세포 내 ROS를 감지하도록 설계된 세포 로슈와 같은 다른 프로브를 시도할 수 있으며 DHE보다 더 포토스터블됩니다.
우리의 프로토콜은 세포 내 ROS 생산을 연구하고 나노 독성 연구에 대한 ROS 수준의 정량화를 연구하기위한 일반적인 개요를 제공합니다. DMSO는 PBS보다 DHE에 대한 더 나은 용매로 알려져 있다. 그러나, DMSO는 독성이 있다.
따라서, 나는 최대 30 분 공부를위한 전체 프로세스를 제한하는 사용자에게 조언하고 싶습니다. 이는 DMSO가 세포 사멸을 일으킬 수 있으므로 거짓 양성 결과를 관찰할 수 있기 때문입니다.
