Nuestros métodos describen una forma simple y repetida para estudiar la nanotoxicidad, como examinar los tipos de muerte celular y examinar la producción de especies reactivas de oxígeno. La clasificación celular activada por fluorescencia es un formato estricto que nos permite estudiar la subpoblación de células y los crecientes tipos de muerte celular. El método de estudio de la sonda DHE nos permite detectar y cuantificar especies reactivas de oxígeno seguidas de citometría de flujo, imágenes microscópicas de alto contenido y análisis de fluorescencia a base de acoplación.
Para comenzar, coloque un tubo Eppendorf que contenga nanopartículas de óxido de zinc en la solución de material de nanopartículas de óxido de zinc en un sonicador durante 15 minutos. Preparar nanopartículas de óxido de zinc a diversas concentraciones utilizando un stock de nanopartículas de óxido de zinc de un miligramo por mililitro. Luego, en un gabinete de bioseguridad, la semilla de fibroblastos pulmonares humanos MRC5 sembra tres placas de cultivo de seis pozos a la concentración de una por 10 a las quintas células por pozo.
Incubar las células a 37 grados centígrados. Después de un día, tratar las células con dos mililitros de nanopartículas de óxido de zinc durante ocho horas, 16 horas o 24 horas. En cada punto de tiempo, recoja las células en un tubo centrífuga de 15 mililitros y centrifugar a 300 veces g durante cinco minutos.
Lave los gránulos celulares dos veces con solución salina tamponada con fosfato, y luego resuspender las células con tampón de unión 1X. A continuación, añada cinco microlitros de la mancha FITC Annexin V en cinco microlitros de tinción de ADN de yoduro propidium. Incubar las células manchadas durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
Antes de ordenar las celdas por citometría de flujo, recubra las muestras con 400 microlitros adicionales de búfer de unión 1X. Tabule el gráfico de barras utilizando la intensidad mediana obtenida. Ahora utilice una pipeta para añadir un mililitro de nanopartículas a diferentes concentraciones en viales, seguido de nueve mililitros de alimentos para mosca para hacer una concentración final de 0,1 miligramos por mililitro, 0,25 miligramos por mililitro, o 0,5 miligramos por mililitro de nanopartículas de óxido de zinc.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Deje que los alimentos mosca que contengan nanopartículas de óxido de zinc se enfríen durante al menos dos o tres horas antes de su uso. Luego anestesia las moscas adultas macho y femenina en un vial con dióxido de carbono, e introduce cinco moscas macho y cinco hembras en cada vial durante cinco días.
Deje que se aparean y pongan huevos en la superficie de los alimentos. Después de la anestesia, retire las moscas parentales y permita que los huevos se sometan a un desarrollo adicional a temperatura ambiente, que consta de cuatro etapas de desarrollo diferentes. Etapa embrionaria, larvaria, pupal y adulta.
Después de 72 a 120 horas, los huevos recién puestos se convierten en larvas de tercera estrella tardías. Usando fórceps, recoger las larvas de la pared de los viales para análisis. En un pozo de un plato de disección con medio de disección o PBS, coloque las larvas en la solución.
Debajo del estereomicroscopio, usa la punta de los fórceps para hacer un pequeño agujero, y abre la capa de cutícula de las larvas. Saca con cuidado el intestino. Coloque el intestino en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga Drosophila Medium de Schneider.
Agregue un microlitro de la sonda DHE e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lávese el intestino tres veces usando Schneider's Medium cada cinco minutos. Monte el intestino en portaobjetos de vidrio y suministre 10 microlitros de medio de montaje antifada que contenga DAPI.
Captura imágenes bajo un microscopio confocal. Para medir la fluorescencia, importe las imágenes de fluorescencia capturadas adquiridas mediante microscopía de fluorescencia o microscopía de escaneo láser confocal en el software ImageJ. Haga clic en el menú Analizar y seleccione Establecer medidas.
Seleccione la medida de salida, como la intensidad integrada del área y el valor gris medio. Seleccione una región sin fluorescencia para establecer el fondo. Haga clic en medir.
Exporte los datos a la hoja de cálculo y determine la fluorescencia total de celdas corregida. Construya un gráfico de barras y realice análisis estadísticos. En este estudio, las células tratadas con nanopartículas de óxido de zinc exhiben un mayor porcentaje de células R3 tempranas o Apoptóticas tardías R6 que las células de control R5. La muerte de células necróticas fue denotada por R4. El intestino extraído de la larva de drosophila se dividió en tres dominios discretos de diferente origen del desarrollo.
A saber, el foregut, midgut, y hindgut. Las acciones de DHE tienden a expirar bastante rápido, así que tenga cuidado con la solución de stock que está utilizando. Alternativamente, usted podría probar otras sondas, por ejemplo la célula Roche, que está diseñada para detectar el ROS intracelular en las señales verdes, y que es más fotostable que el DHE.
Nuestro protocolo proporciona un esquema general para el estudio de la producción de ROS intracelular, y la cuantificación del nivel de ROS para el estudio de nanotoxicidad. DMSO es conocido por ser un mejor disolvente para DHE que el PBS. Sin embargo, DMSO es tóxico.
Por lo tanto, me gustaría aconsejar al usuario que restrinja todo el proceso para estudiar a un máximo de 30 minutos. Esto se debe a que usted puede observar un resultado falso positivo ya que DMSO puede causar la muerte celular.
