Наши методы наметить простой и повторяющийся способ изучения нанотоксичности, таких как изучение типов гибели клеток и изучение производства реактивных видов кислорода. Флуоресценция активированной сортировки клеток является строгим форматом, который позволяет нам изучать субпопуляцию клеток и растущие различные типы клеточной смерти. Метод исследования зонда DHE позволяет нам обнаруживать и количественно давать количественную оценку реактивным видам кислорода с последующим цитометрией потока, микроскопической высококонтентной визуализацией и парным анализом флуоресценции.
Для начала поместите трубку Эппендорфа, содержащую наночастицы оксида цинка, в раствор наночастиц оксида цинка в звуковой в течение 15 минут. Подготовка наночастиц оксида цинка в различных концентрациях с использованием одного миллиграмма на миллилитр наночастицы оксида цинка фонда. Затем, в кабинете биобезопасности, семена MRC5 человека легкого фибробластов на три шесть хорошо культуры пластин при концентрации один раз от 10 до пятой клетки на колодец.
Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию. После одного дня, лечить клетки с двумя миллилитров наночастиц оксида цинка в течение восьми часов, 16 часов или 24 часов. В каждый момент времени собирайте клетки в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу по 300 раз г в течение пяти минут.
Вымойте клеточные гранулы дважды фосфатно-буферным солевым раствором, а затем повторно поместите клетки с 1X связывающим буфером. Далее добавьте пять микролитров пятна FITC Annexin V в пять микролитров пятна ДНК пропидия йодида. Инкубировать окрашенные клетки в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
Перед сортировкой клеток по цитометрии потока, пополнить образцы с дополнительными 400 микролитров 1X связывающего буфера. Табулировать диаграмму бара, используя полученную медианную интенсивность. Теперь используйте пипетку, чтобы добавить один миллилитр наночастиц в различных концентрациях во флаконы, а затем девять миллилитров мухи пищи, чтобы сделать окончательную концентрацию 0,1 миллиграмма на миллилитр, 0,25 миллиграмма на миллилитр, или 0,5 миллиграмма на миллилитр наночастиц оксида цинка.
Pipette вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Разрешить летать пищи, содержащей наночастицы оксида цинка для охлаждения, по крайней мере два-три часа до использования. Затем обезболивать взрослых самцов и самок мух во флаконе с углекислым газом, и ввести пять самцов мух и пять самок мух в каждый флакон в течение пяти дней.
Дайте им спариваться и откладывать яйца на поверхности пищи. После анестезии удалите родительских мух и позвольте яйцам пройти дальнейшее развитие при комнатной температуре, которая состоит из четырех различных стадий развития. Эмбриональная, личинка, куколка и взрослая стадия.
После 72 до 120 часов, свежеотложенные яйца превращаются в поздние третьи личинки instar. Используя типсы, соберите личинки со стенки флаконов для анализа. В колодец рассечения блюдо с вскрытием среды или PBS, поместите личинки в раствор.
Под стереомикроскопом используйте кончик типса, чтобы сделать крошечное отверстие, и откройте слой кутикулы личинок. Осторожно вытащите кишечник. Поместите кишечник в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую drosophila Medium Шнайдера.
Добавьте один микролитер зонда DHE и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Вымойте кишечник три раза с помощью Среднего Шнайдера каждые пять минут. Намонтайте кишечник на стеклянные горки и поставь 10 микролитров антифадной крепления среды, содержащей DAPI.
Захват изображений под конфокальные микроскопы. Для измерения флуоресценции импортируют захваченные изображения флуоресценции, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокального лазерного сканирования микроскопии в программное обеспечение ImageJ. Нажмите на меню анализа и выберите набор измерений.
Выберите меру вывода, такую как интенсивность интегрированной области и среднее серое значение. Выберите область без флуоресценции, чтобы установить фон. Нажмите меру.
Экспорт данных в электронную таблицу и определение исправленной общей флуоресценции клеток. Создать диаграмму баров и выполнить статистический анализ. В этом исследовании, оксид цинка наночастицы обработанные клетки демонстрируют более высокий процент ранних R3 или поздних апоптотических R6 клеток, чем контрольные клетки R5. Смерть некротических клеток была обозначена R4. Кишечник, извлеченный из личинки дрозофилы, был разделен на три дискретные области различного развития.
А именно, foregut, midgut, и hindgut. DHE акции, как правило, истекает довольно быстро, так что будьте осторожны с фондовым решением вы используете. Кроме того, вы можете попробовать другие зонды, например, ячейку Roche, которая предназначена для обнаружения внутриклеточного ROS в зеленых сигналах, и это более фотосвидетель, чем DHE.
Наш протокол содержит общий план для изучения внутриклеточного производства ROS и количественной оценки уровня ROS для исследования нанотоксичности. DMSO, как известно, лучше растворителя для DHE, чем PBS. Тем не менее, DMSO является токсичным.
Поэтому я хотел бы посоветовать пользователю ограничить весь процесс обучения максимум 30 минутами. Это потому, что вы можете наблюдать ложноположивной результат, как DMSO может привести к гибели клеток.
