细胞培养和果蝇黑色素的氧化锌纳米颗粒的毒性研究

我们的方法概述了研究纳米毒性的简单而重复的方法，例如检查细胞死亡的类型和检查活性氧物种的产生。荧光激活细胞分拣是一种严格的格式，使我们能够研究细胞的亚细胞和生长不同类型的细胞死亡。DHE探针研究方法使我们能够检测和量化活性氧物种，然后进行流动细胞学、微观高含量成像和基于对对的荧光分析。

首先，将含有氧化锌纳米颗粒的Eppendorf管放入氧化锌纳米颗粒溶液中，放入声波器中15分钟。使用每毫升一毫克的氧化锌纳米粒子储存各种浓度的氧化锌纳米粒子。然后，在生物安全柜中，将 MRC5 人类肺成纤维细胞种子到三个六孔培养板上，浓度为每孔10至第5个细胞的1倍。

在37摄氏度下孵育细胞。一天后，用两毫升氧化锌纳米粒子处理细胞8小时、16小时或24小时。在每个时间点，将细胞收集到15毫升的离心管中，以300倍g的离心器进行5分钟。

用磷酸盐缓冲的盐水清洗细胞颗粒两次，然后用1X结合缓冲液重新暂停细胞。接下来，在五微升碘化DNA染色中加入5个菲特基附件五染色的微升。在黑暗中的室温下孵育染色细胞15分钟。

在通过流式细胞学对细胞进行排序之前，再用 400 微升 1X 结合缓冲液对样品进行补充。使用获得的中位数强度对条形图进行制表。现在使用移液器将不同浓度的一毫升纳米颗粒加入小瓶中，然后加入9毫升的飞食，使最终浓度为每毫升0.1毫克，每毫升0.25毫克，或每毫升氧化锌纳米颗粒0.5毫克。

上下移液，彻底混合。允许含有氧化锌纳米颗粒的飞食在使用前至少冷却两到三个小时。然后麻醉成年的雄蝇和雌性苍蝇在小瓶与二氧化碳，并引入五公苍蝇和五只雌性苍蝇到每个小瓶五天。

允许他们交配，并在食物表面产卵。麻醉后，取出父母的苍蝇，让卵子在室温下进一步发育，室温由四个不同的发育阶段组成。胚胎、幼虫、幼虫和成人阶段。

72至120小时后，新鲜产卵发育成晚三星幼虫。使用钳子，从小瓶壁上收集幼虫进行分析。在具有解剖介质或 PBS 的解剖盘中，将幼虫放入溶液中。

在立体显微镜下，用钳子的尖端做一个小孔，并打破幼虫的角质层。小心地拉出肠道。将肠道放入含有施耐德嗜血杆的1.5毫升微离心管中。

加入一个微升的DHE探头，在室温下在黑暗中孵育10分钟。每五分钟用施耐德的中位清洗三次肠道。将肠子安装到玻璃幻灯片上，并提供 10 微升含有 DAPI 的防淡安装介质。

在共和显微镜下捕捉图像。要测量荧光，请将使用荧光显微镜或共声激光扫描显微镜采集的荧光图像导入 ImageJ 软件。单击分析菜单，然后选择设置的测量值。

选择输出度量，如区域综合强度和平均灰色值。选择无荧光区域以设置背景。单击度量值。

将数据导出到电子表格中，并确定校正的总细胞荧光。构建条形图，并执行统计分析。在这项研究中，氧化锌纳米粒子处理细胞表现出比控制细胞R5更高的早期R3或晚期凋亡R6细胞的百分比。坏死细胞死亡用R4表示。从果蝇幼虫中提取的肠道被分为三个不同发育起源的离散域。

也就是说， 前腿， 中， 和后。DHE 股票往往很快过期，因此请注意您使用的股票解决方案。或者，您可以尝试其他探测器，例如细胞罗氏，它旨在检测绿色信号中的细胞内 ROS，并且比 DHE 更可光。

我们的协议为研究细胞内ROS生产提供了总体大纲，并为纳米毒性研究提供了ROS水平的量化。众所周知，DMSO 是 DHE 比 PBS 更好的溶剂。然而，DMSO是有毒的。

因此，我想建议用户将学习的整个过程限制在30分钟以上。这是因为您可能会观察到误报结果，因为 DMSO 可能会导致细胞死亡。