Nossos métodos delineiam uma maneira simples e repetida de estudar a nanotoxicidade, como examinar os tipos de morte celular e examinar a produção de espécies reativas de oxigênio. A fluorescência ativada de classificação celular é um formato rigoroso que nos permite estudar a subpopulação das células e os diferentes tipos de morte celular. O método de estudo da sonda DHE nos permite detectar e quantificar espécies reativas de oxigênio seguidas de citometria de fluxo, imagens microscópicas de alto conteúdo e por análise de fluorescência baseada em acoplamento.
Para começar, coloque um tubo Eppendorf contendo nanopartículas de óxido de zinco em solução de nanopartículas de óxido de zinco em um sonicator por 15 minutos. Prepare as nanopartículas de óxido de zinco em várias concentrações usando um estoque de nanopartículas de óxido de zinco de um miligrama. Então, em um armário de biossegurança, os fibroblastos pulmonares humanos MRC5 em três placas de seis poços de cultura na concentração de uma vez 10 para as quintas células por poço.
Incubar as células a 37 graus Celsius. Após um dia, trate as células com dois mililitros de nanopartículas de óxido de zinco por oito horas, 16 horas ou 24 horas. Em cada ponto de tempo, colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 300 vezes g por cinco minutos.
Lave as pelotas celulares duas vezes com soro fisiológico tamponado por fosfato e, em seguida, resuspense as células com tampão de ligação 1X. Em seguida, adicione cinco microliters de mancha FITC Annexin V em cinco microliters de mancha de DNA de iodeto propidium. Incubar as células manchadas por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
Antes de classificar as células por citometria de fluxo, cubra as amostras com um buffer adicional de 400 microliters de 1X. Tabular o gráfico de barras usando a intensidade mediana obtida. Agora use uma pipeta para adicionar um mililitro de nanopartículas em diferentes concentrações em frascos, seguido por nove mililitros de alimentos voadores para fazer uma concentração final de 0,1 miligramas por mililitro, 0,25 miligramas por mililitro, ou 0,5 miligramas por nanopartículas de óxido de zinco mililitro.
Pipeta para cima e para baixo para misturar bem. Permita que os alimentos de mosca que contenham nanopartículas de óxido de zinco esfriem por pelo menos duas a três horas antes do uso. Em seguida, anestesiar moscas adultas macho e fêmea em um frasco com dióxido de carbono, e introduzir cinco moscas machos e cinco moscas fêmeas em cada frasco por cinco dias.
Permita-lhes acasalar e colocar ovos na superfície do alimento. Após a anestesia, remova as moscas parentais e permita que os ovos se submetam a um novo desenvolvimento à temperatura ambiente, que consiste em quatro estágios diferentes de desenvolvimento. Estágio embrionário, larval, pupal e adulto.
Após 72 a 120 horas, ovos recém-colocados se desenvolvem em terceiras larvas instar. Usando fórceps, recolhe as larvas da parede dos frascos para análises. Em um poço de um prato de dissecção com meio de dissecção ou PBS, coloque as larvas na solução.
Sob o estereótipo, use a ponta dos fórceps para fazer um pequeno buraco, e abra a camada de cutícula das larvas. Puxe cuidadosamente o intestino. Coloque o intestino em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo o Meio Drosophila de Schneider.
Adicione um microliter da sonda DHE e incubar no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos. Lave o intestino três vezes usando o Meio de Schneider a cada cinco minutos. Monte o intestino em lâminas de vidro e forneça com 10 microliters de meio de montagem antifado contendo DAPI.
Capture imagens sob um microscópio confocal. Para medir a fluorescência, importe as imagens de fluorescência capturadas adquiridas usando microscopia de fluorescência ou microscopia de varredura a laser confocal no software ImageJ. Clique no menu analisar e selecione definir medidas.
Selecione a medida de saída, como intensidade integrada de área e valor cinza médio. Selecione uma região sem fluorescência para definir o fundo. Clique na medida.
Exporte os dados para a planilha e determine a fluorescência celular total corrigida. Construa um gráfico de barras e realize análises estatísticas. Neste estudo, as células tratadas com nanopartículas de óxido de zinco apresentam uma porcentagem maior de células R6 apoptóticas precoces ou tardias do que as células de controle R5. A morte da célula necrosada foi denotada pelo R4. O intestino extraído da larva de drosophila foi dividido em três domínios discretos de diferentes origens de desenvolvimento.
Ou seja, o foregut, midgut e hindgut. As ações da DHE tendem a expirar rapidamente, por isso tenha cuidado com a solução de estoque que você está usando. Alternativamente, você pode experimentar outras sondas, por exemplo, cell Roche, que foi projetada para detectar o ROS intracelular em sinais verdes, e que é mais fotostível do que o DHE.
Nosso protocolo fornece um esboço geral para estudar a produção de ROS intracelular, e quantificação do nível ros para estudo de nanotoxicidade. O DMSO é conhecido por ser um solvente melhor para o DHE do que o PBS. No entanto, o DMSO é tóxico.
Portanto, gostaria de aconselhar o usuário a restringir todo o processo para estudar até 30 minutos no máximo. Isso porque você pode observar um resultado falso positivo, pois o DMSO pode causar morte celular.
