يوفر هذا البروتوكول إطارًا لدراسة دمج الأحماض الدهنية الخارجية من المصادر المضيفة المعقدة في الأغشية البكتيرية ، ولا سيما المكورات العنقودية. يستخدم البروتوكول تحليل الدهون غير المتحيزة وجزيئات البروتين الدهني المعزولة من صفار بيض الدجاج كمصدر اقتصادي للأحماض الدهنية المعقدة لتحديد دمج الأحماض الدهنية في الدهون البكتيرية. تصف تقنيات قياس الطيف الشامل هنا تقديم منظور لا مثيل له من الأحماض الدهنية من الدهون المكورات العنقودية aureus ، ولكن يمكن تكييفها لدراسة الأغشية البكتيرية الأخرى.
عند تنفيذ هذا البروتوكول، يجب توخي الحذر أن كل خطوة تجزئة لتحديد والاحتفاظ بالكسر الذي يحتوي على LDL. إزالة كبريتات الأمونيا من جزء البلازما أمر بالغ الأهمية لتطبيقات المصب LDLs. توفير مساحة واسعة في أنابيب وتغيير المياه حسب الحاجة للسماح غسيل الكلى الفعال.
للبدء، وغسل اثنين صفار البيض مرتين مع 30 ملليلتر من الفوسفات المعقم المخزنة المالحة لإزالة الألبومين المتبقية. ثقب غشاء vitelline مع تلميح الماصات العقيمة واستنزاف محتويات الغشاء في أنبوب مخروطي معقم. إضافة ما يقرب من 24 إلى 30 ملليلتر أو 17 محلول كلوريد الصوديوم الضرس في رقم هيدروفلوري سبعة إلى صفار البيض ويخلط بقوة.
ثم ضع الأنبوب على شاكر هزاز لخلط في أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. الطرد المركزي البيض صفار تخفيف في 10 درجة مئوية في 10، 000 مرات ز لمدة 45 دقيقة. نقل جزء البلازما الفائقة إلى أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر، تاركاً وراءه الكسر الحبيبي.
وطاردة مركزية مرة أخرى أولاً، اخلطي كسر البلازما مع 40 حجم كتلة في المئة كبريتات الأمونيوم على شاكر هزاز أو جهاز مماثل عند أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد ضبط درجة PH، الطرد المركزي كسر البلازما في أربع درجات مئوية و 10، 000 الوقت ز لمدة 45 دقيقة.
إزالة الجزء الأصفر شبه سوليد العلوي إلى سبعة كيلودالون المسام حجم أنابيب غسيل الكلى. توفير ما لا يقل عن 25٪ من الغرفة الإضافية في الأنابيب للسماح لها أن تنتفخ. ضع أنابيب غسيل الكلى في ثلاثة لترات من الماء فائق البور لـ dialyze بين عشية وضحاها عند ثلاث درجات مئوية لإزالة كبريتات الأمونيوم.
بعد غسيل الكلى، الطرد المركزي الحل في أربع درجات مئوية كما هو موضح سابقا. إزالة بعناية العلوي، نصف الكسر الأصفر إلى أنبوب معقمة وتخزينها في أربع درجات مئوية. بعد حضانة بين عشية وضحاها من الثقافة، ونقل 500 ميكرولترات إلى اثنين من قارورة 250 ملليلتر معقم حيرة تحتوي على 49.5 ملليلتر من 1٪ مرق tryptone.
احتضان لمدة أربع ساعات تقريبا في 37 درجة مئوية مع اهتزاز للوصول إلى مرحلة منتصف طويلة. نقل 100 ملليلتر من الثقافة في 25 ملليلتر زيادات إلى أربعة معقمة 50 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي الأربعة أنابيب في 10، 000 مرات ز إلى بيليه الخلايا. إزالة افرنح وإعادة تعليق كل بيليه الخلية في 750 ميكرولترات من 1٪ مرق tryptone.
الجمع بين أربعة 750 microliter تعليق الخلية في أنبوب واحد 15 ملليلتر. و aliquot 350 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى ستة أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر معقمة. استخدام ماصة لإضافة 30 ميكرولترات من LDLs في أنبوب جهاز الطرد المركزي 1.5 ملليلتر لتحقيق التركيز النهائي المطلوب من 5٪ واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة أربع ساعات.
أجهزة الطرد المركزي الثقافات في أربع درجات مئوية في 16،000 مرات ز لمدة دقيقتين. وإعادة تعليق الكريات الخلية في 330 ميكرولترات من المالحة المعقمة الفوسفات المخزنة على الغسيل. كرر هذا غسل مرة أخرى.
سجل وزن الكريات الستة من الخلايا الرطبة عن طريق طرح وزن الأنبوب الفارغ. المفاجئة تجميد الكريات الخلية على الجليد الجاف. أولا إضافة مغرفة واحدة من 5 ملليمتر حبات أكسيد الزركونيوم على رأس كل بيليه الخلية.
إضافة 740 ميكرولترات من 75٪ HPLC الصف الميثانول مبردة إلى ناقص 80 درجة مئوية مباشرة في كل أنبوب. ثم إضافة اثنين microliters من 50 dimyristoyl ميكرومولر فوسفاتيديل كولين كمعيار داخلي. ضع العينة التي تحتوي على أنابيب أجهزة طرد مركزي 1.5 ملليلتر في منفذ متاح على مزج نسيج الخلاط الرصاص.
التجانس العينات على سرعة منخفضة. وضع اثنين إلى ثلاثة لمدة ثلاث دقائق. فحص العينات بصرياً بحثاً عن التجانس.
إذا كانت كتل الخلايا مرئية، فتابع تجانس في الخلاط النقطي بزيادات دقيقة. أضف التالي 270 ميكرولترات من الكلوروفورم لكل عينة في غطاء أبخرة كيميائية. دوامة العينات بقوة لمدة 30 دقيقة.
أجهزة الطرد المركزي العينات في جهاز طرد مركزي على مقاعد البدلاء لمدة تصل إلى 30 دقيقة على الأقل 2،000 مرات ز. في غطاء محرك السيارة الدخان الكيميائية، وجمع نابيرات أحادية الطور ونقلها إلى أنبوب اختبار جديد مع تجنب بعناية بيليه البروتين في الجزء السفلي من أنبوب الاستخراج. نقل مستخلصات الدهون المخففة التي تم إعدادها مسبقًا إلى قارورة اختزال تلقائي مناسبة.
للتحليل القائم على حقن التدفق، ضع قارورة الختم التلقائي في ampler التي يتم التحكم فيها بدرجة حرارة لنظام HPLC القادر على تطبيقات تدفق الشعيرات الدموية. إعداد نظام HPLC وفقا للمخطوطة. يتم إدخال الـ eluent من خط نقل HPLC إلى مطياف الكتلة من خلال مصدر التأين الكهربائي المجهز بإبرة معدنية منخفضة التدفق 34 مقياس.
في برنامج التحكم في أداة Thermo Tune Plus ، قم بتعيين جهد التأين إلى 4000 فولت وغاز غغام إلى خمسة. وبالمثل، قم بتعيين درجة حرارة الشعيرية إلى 150 درجة مئوية وعدسة S إلى 50٪ انقر فوق زر الفحص، وفي قائمة المحلل، حدد FTMS. تعيين حقل النطاق الشامل إلى عادي وفي حقل الدقة، حدد 100, 000.
تأكد من تعيين نوع المسح الضوئي إلى كامل. تحت قائمة نطاقات المسح الضوئي، أدخل 200 في حقل الكتلة الأولى وأدخل 2000 في حقل الكتلة الأخيرة. بعد زيادة تحديد دقة الكتلة الملاحظة، متوسط الإشارة عبر ذروة واسعة في الكروماتوغرافية الأيونية الإجمالية.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق رمز thumbtack في نافذة عرض الطيف الشامل وحدد قائمة طيف العرض. من نفس القائمة، حدد خيارات العرض ثم كل مربع تبديل قمم في قائمة العرض. انقر فوق الزر "موافق" لإغلاق نافذة العرض.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق رمز thumbtack في إطار عرض الطيف الشامل مرة أخرى وحدد كتلة الحافظة التصدير بالضبط. قم بلصق خلية البيانات المصدرة A1 من ورقة العمل الأولى في جدول بيانات Excel الجديد ثم تابعها وفقًا للمخطوطة. لتنفيذ دقيقة تحديد الدهون على أساس الكتلة، افتح برنامج LIMSA.
من القائمة الرئيسية، حدد قائمة الذروة ضمن قائمة نوع الطيف. حدد الوضع الإيجابي أو الوضع السلبي ليتوافق مع القطبية التي تم فيها الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي. في ذروة العرض الكامل في نصف أقصى وأكثر من نافذة ض، أدخل نافذة البحث الجماعي المطلوب لإيجاد الذروة.
في هذا البروتوكول، تم إثراء محتوى LDL من جزء البلازما عن طريق هطول الأمطار من 30 إلى 40 كيلودالون بيتا ليفيتينس. وجود عصابات البروتين في 140, 80, 65, 60, و 15 كيلودالون يرتبط مع apoproteins من LDLs. العلاج مع التريكلوسان يمنع نمو المكورات الآريوس في المتوسطة الدهنية خالية من الأحماض.
في حين أن المكمل الثقافات مع البلازما صفار البيض ومصادر الأحماض الدهنية الخارجية يتغلب على تثبيط النمو الناجم عن التريكلوسان. وبالمثل، مكملات الثقافات المعالجة بالتريكلوسان مع صفار البيض المخصب LDL يعيد النمو. علاوة على ذلك، إضافة من البيض LDLs صفار يدعم نمو الأحماض الدهنية S.aureus تتميز سابقا، أوكستروف.
تم قياس محتوى الأحماض الدهنية قبل في 1٪ مرق tryptone أو صفار بيض الدجاج LDL عن طريق توظيف حقن تدفق عالية الدقة قياس الطيف الشامل دقيقة. تم العثور على كميات ضئيلة من الأحماض الدهنية الحرة. المتعامدة جزئية أقل المربعات تحليل discriminant من غشاء غشاء غشاء المكورات العنقودية وفيرة phospholipids أظهرت فصل الطبقة واضحة, مع تكوين الأحماض الدهنية من غير المعالجة والدجاج البيض صفار LDL الظروف المعالجة.
إن إثراء LDLs من صفار بيض الدجاج يوفر مصدرًا غير مكلف للأحماض الدهنية المعقدة للتحقيق في التفاعلات بين مسببات الأمراض البكتيرية وبروتينات الدهون المضيفة. الكلوروفورم والميثانول المستخدمة في إعداد مستخلصات الدهون خطرة. يرجى التأكد من استخدام هذه الكواشف في غطاء الدخان الكيميائي وتحتوي على جميع تيارات النفايات.
