このプロトコルは、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌への外因性脂肪酸の取り込みを研究するためのフレームワークを提供する。このプロトコルは、鶏卵黄から分離された公平なリピドミック分析とリポタンパク質粒子を、脂肪酸を細菌脂質に組み込むものを定量化する複雑な脂肪酸の経済的源として利用しています。質量分析技術は、ここで記載されているブドウ球菌脂質の脂肪酸プロファイルの比類のない視点を提供するが、他の細菌膜を研究するために適応することができる。
このプロトコルを実行する場合は、LDL 含有分数を識別して保持するために、各分数処理手順に注意する必要があります。血漿分画からの硫酸アンモニアの除去は、LDLの下流の用途に不可欠です。
まず、2つの卵黄を30ミリリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、残りのアルブミンを除去します。無菌ピペットチップでビテリン膜を穿刺し、無菌50ミリリットル円錐形遠心管に膜の内容物を排出します。卵黄にpH 7で約24〜30ミリリットルまたは17モル塩化ナトリウム溶液を加え、激しく混ぜます。
その後、ロッキングシェーカーの上にチューブを置き、摂氏4度で60分間混ぜます。卵黄希釈液を摂氏10度で10,000倍gで45分間遠心分離する。上清プラズマ分を無菌50ミリリットル円錐形チューブに移し、ペレット状の粒状分画を残します。
そして再び遠心分離機。まず、4°Cのロッキングシェーカーまたは同様の装置で、プラズマ分率を40質量体積%硫酸アンモニウムと60分間混合します。pHを調整した後、45分間、プラズマ画分を摂氏4度、10,000時間gで遠心分離する。
上部半固体黄色の分率を7キロダルトンの孔サイズ透析管に取り除く。チュービングに25%以上の余分な部屋を用意して膨らませます。透析チューブを3リットルの超純水に入れ、硫酸アンモニウムを取り除くために一晩透析を摂氏3度で下します。
透析後、前述のように摂氏4度で溶液を遠心分離する。上半固体の黄色分率を滅菌チューブに慎重に取り出し、摂氏4度で保管します。培養物を一晩培養した後、500マイクロリットルを1%トリプコンブロスの49.5ミリリットルを含む2つの無菌250ミリリットルバッフルフラスコに移す。
摂氏37度で約4時間インキュベートし、揺れが中期に達する。100ミリリットルの培養物を25ミリリットル単位で4本の無菌50ミリリットル遠心管に移し、4本のチューブを10,000gで遠心分離して細胞をペレット化する。上清を取り除き、1%トリプトンブロスの750マイクロリットルの各細胞ペレットを再中断します。
4つの750マイクロリットルセルサスペンションを15ミリリットルチューブに組み合わせます。そしてアリコート350マイクロリットルの細胞懸濁液を6つの無菌1.5ミリリットル遠心分離管に入った。ピペットを使用して1.5ミリリットル遠心分離管に30マイクロリットルのLLDを加え、所望の最終濃度5%を達成し、摂氏37度で4時間の振盪を行います。
2分間16,000倍のgで摂氏4度で文化を遠心分離します。そして、洗浄するために330マイクロリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水中の細胞ペレットを再懸濁する。この洗浄をもう一度繰り返します。
空の管の重量を減算して、6つの湿潤細胞ペレットの重量を記録する。スナップはドライアイス上の細胞ペレットを凍結します。まず、各細胞ペレットの上に5ミリメートル酸化ジルコニウムビーズの1スクープを追加します。
740マイクロリットルの740マイクロリットルの75%HPLCグレードのメタノールをマイナス80°Cまで直接各チューブに加えます。次に、50マイクロモルジミリストイルホスファチジルコリンの2マイクロリットルを内部標準として追加します。1.5ミリリットルの遠心分離管を含むサンプルを弾丸ブレンダー組織ホモジナイザーの利用可能なポートに入れる。
サンプルを低速で均質化します。2~3分の間に3分を設定します。サンプルの均質性を視覚的に検査します。
セルの束が見える場合は、弾丸ブレンダーで 2 分ずつ均質化を続けます。次に、化学ヒュームフードの各サンプルにクロロホルムの270マイクロリットルを追加します。30分間、サンプルを激しく渦にかけます。
ベンチトップ遠心分離機のサンプルを最低2,000回gで最大30分間遠心分離します。化学煙フードでは、モノファシカル上清を収集し、抽出管の底にあるタンパク質ペレットを慎重に避けながら、新しい試験管に移します。あらかじめ調製した希釈脂質抽出物を適切なオートサンプラーバイアルに移す。
フローインジェクションベースの解析では、オートサンプラーバイアルをキャピラリーフローアプリケーションが可能なHPLCシステムの温度制御オートサンプラーに配置します。原稿に従ってHPLCシステムを設定します。溶離液は、HPLC移送ラインから質量分析計に、低流量34ゲージの金属針を取り付けたエレクトロスプレーイオン化源を介して導入される。
Thermo Tune Plus の計測器制御ソフトウェアで、イオン化電圧を 4,000 ボルト、シースガスを 5 に設定します。同様に、キャピラリー温度を摂氏150度に設定し、Sレンズを50%に設定して、スキャンを定義ボタンをクリックし、アナライザーメニューでFTMSを選択します。質量範囲フィールドを標準に設定し、解像度フィールドで 100,000 を選択します。
スキャンの種類が [完全] に設定されていることを確認します。スキャン範囲メニューで、最初の質量フィールドに 200 と入力し、最後の質量フィールドに 2,000 と入力します。観測質量精度をさらに定義した後、全イオンクロマトグラムの広いピークを横切る信号を平均化します。
マススペクトル表示ウィンドウでサムタックアイコンを右クリックし、スペクトル表示リストを選択します。同じメニューから表示オプションを選択し、表示メニューのすべてのピークトグルボックスを選択します。[大丈夫]ボタンをクリックして、表示ウィンドウを閉じます。
マススペクトル表示ウィンドウで thumbtack アイコンをもう一度右クリックし、エクスポートクリップボードの正確な質量を選択します。最初のワークシートのエクスポートされたデータセルA1を新しいExcelスプレッドシートに貼り付け、原稿に従って処理を進めます。正確な質量ベースの脂質同定を行うために、LIMSAソフトウェアを開いてください。
メインメニューから、スペクトルタイプメニューのピークリストを選択します。質量分析データが取得された極性に対応するには、正のモードまたは負のモードを選択します。ピークの最大の最大と z の上のピークの全幅で、ピーク検索のための目的のマス検索ウィンドウを入力します。
このプロトコルでは、血漿分画のLDL含有量は、30〜40キロダルトンβレビチンの沈殿によってさらに濃縮された。140、80、65、60、および15キロダルトンのタンパク質バンドの存在は、LDLのアポタンパク質と相関します。
外因性脂肪酸源として卵黄血漿で培養物を補いながら、トリクロサン誘発性の成長阻害を克服する。同様に, 富化卵黄 LDL とトリクロサン処理培養の補充は、成長を復元します。.また、卵黄LDLの添加は、以前に特徴づけられていたS.アウレウス脂肪酸、食後の成長を支える。
プレ脂肪酸含量は、フロー注入高分解能精度質量分析法を採用することにより、1%トリプトンブロスまたは鶏卵黄LDLで測定した。遊離脂肪酸の最小量が見つかりました.豊富なステープル・アウレウス膜リン脂質の直交部分最小二乗法分析は、未処理の脂肪酸組成と鶏卵黄LDL処理条件下で明確なクラス分離を示した。
鶏卵黄からのLDLの濃縮は、細菌病原体と宿主リポタンパク質との相互作用を調査するための複雑な脂肪酸の安価な供給源を提供する。脂質抽出物の調製に用いるクロロホルムおよびメタノールは危険である。これらの試薬は化学発煙フードに入れて使用し、すべての廃棄物の流れを含めてください。
