Bu protokol, kompleks konak kaynaklardan eksojen yağ asitlerinin bakteri zarlarına, özellikle staphylococcus aureus'a dahil edilmesi için bir çerçeve sağlar. Protokol, bakterilipine yağ asidi eklenmesini ölçmek için karmaşık yağ asitlerinin ekonomik kaynağı olarak tavuk yumurtası sarısından izole edilen tarafsız lipidomik analiz ve lipoprotein partiküllerini kullanmaktadır. Kütle spektrometresi teknikleri burada staphylococcus aureus lipidlerin yağ asidi profili benzersiz bir bakış açısı sunmak açıklar, ancak diğer bakteri membranları çalışmaya adapte edilebilir.
Bu protokolü gerçekleştirirken, LDL içeren fraksiyonu tanımlamak ve korumak için her kesirasyon adımına dikkat edilmelidir. Plazma fraksiyonundan amonson sülfat çıkarılması LDLs downstream uygulamaları için önemlidir.
Başlamak için, iki yumurta sarısı iki kez steril fosfat tamponlu tuzlu 30 mililitre ile yıkamak artık albumin kaldırmak için. Vitellin membranını steril pipet ucuyla delin ve membranın içeriğini steril 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne boşaltın. Yaklaşık 24 ila 30 mililitre veya 17 molar sodyum klorür çözeltisi pH yedi yumurta sarısı ekleyin ve şiddetle karıştırın.
Sonra 60 dakika boyunca dört derece santigrat karıştırmak için bir sallanan shaker üzerine tüp yerleştirin. 45 dakika boyunca 10 santigrat derecede yumurta sarısı seyreltme santrifüj 10, 000 kez g 45 dakika. Supernatant plazma fraksiyonu steril 50 mililitre konik tüp içine transfer, peletli granüler fraksiyonu geride bırakarak.
Ve yine santrifüj. İlk olarak, 60 dakika boyunca dört derece santigrat bir sallanan shaker veya benzer bir cihaz üzerinde 40 kütle hacmi yüzde amonyum sülfat ile plazma fraksiyonu karıştırın. pH'ı ayarladıktan sonra plazma fraksiyonu 45 dakika süreyle dört santigrat derece ve 10,000 zaman g'de santrifüj edin.
Yedi kilodalton gözenek boyutu diyaliz tüpü içine üst yarı katı sarı fraksiyonu çıkarın. Şişmesi için tüp ekstra oda en az% 25 sağlayın. Amonyum sülfat kaldırmak için üç derece santigrat gecede diyaliz için ultrasaf su üç litre diyaliz tüpü yerleştirin.
Diyalizden sonra çözeltiyi daha önce açıklandığı gibi dört santigrat derecede santrifüj edin. Üst, yarı katı sarı fraksiyonu steril bir tüpe dikkatlice çıkarın ve dört santigrat derecede saklayın. Kültürün bir gecede kuluçkasonra, iki steril 250 mililitre baffled şişeler içine 500 mikrolitre aktarın 49.5 mililitre içeren 1% tripon suyu.
37 santigrat derecede yaklaşık dört saat boyunca inkübed ve orta-uzun fazulaşmak için sallayarak. 25 mililitrelik artışlarla 100 mililitre kültürü dört steril 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve dört tüpü 10,000 kez g'de santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve % 1 tripon suyu 750 mikrolitre her hücre pelet yeniden askıya.
Tek bir 15 mililitrelik tüp içine dört 750 mikrolitre hücre süspansiyonlar birleştirin. Ve aliquot 350 mikrolitre hücre süspansiyonu altı steril 1.5 mililitre lik santrifüj tüpüne dönüşür. İstenilen son konsantrasyonu %5'e çıkarmak için 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne 30 mikrolitre LDL eklemek için bir pipet kullanın ve 4 saat boyunca sallayarak 37 derecede kuluçkaya yatın.
Kültürleri 16,000 kez g'de dört derece santigrat derecede iki dakika süreyle santrifüj edin. Ve 330 mikrolitre steril fosfat tamponlu tuzlu suyla hücre peletlerini yeniden askıya alın. Bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
Boş tüpün ağırlığını çıkararak altı ıslak hücreli peletin ağırlığını kaydedin. Snap kuru buz üzerinde hücre pelet dondurmak. İlk her hücre pelet üstüne 5 milimetre zirkonyum oksit boncuk bir kepçe ekleyin.
Her tüp içine eksi 80 santigrat derece soğutulmuş 75% HPLC sınıf metanol 740 mikrolitre ekleyin. Sonra bir iç standart olarak 50 mikromistoil fosfatidilkolin iki mikrolitre ekleyin. 1,5 mililitrelik santrifüj tüpleriçeren numuneyi bir mermi blender doku homogenizer üzerinde kullanılabilir bir bağlantı noktasına yerleştirin.
Düşük hızda örnekleri homojenize. Üç dakika için 2-3 ayarlı. Homojenlik için örnekleri görsel olarak inceleyin.
Hücre kümeleri görünürse, iki dakikalık artışlarla mermi karıştırıcısında homojenleştirmeye devam edin. Sonraki kimyasal duman kaputunda her örnek için kloroform 270 mikrolitre ekleyin. 30 dakika boyunca güçlü bir şekilde örnekleri girdap.
Numuneleri en az 2,000 kez 30 dakikaya kadar bir bank üstü santrifüjde santrifüj edin. Kimyasal duman kaputunda, monophasik supernatant toplamak ve dikkatle ekstraksiyon tüpünün altındaki protein pelet kaçınarak yeni bir test tüpü ne aktarın. Daha önce hazırlanan seyreltilmiş lipid ekstrelerini uygun bir otoörnekleyici şişeye aktarın.
Akış enjeksiyonu tabanlı analiz için, otosampler şişelerini kapiller akış uygulamaları yapabilen bir HPLC sisteminin sıcaklık kontrollü otoörnekleyicisine yerleştirin. El yazmasına göre HPLC sistemini kur. Elüent, HPLC transfer hattından kütle spektrometresine düşük akışlı 34 gauge metal iğne ile donatılmış bir elektrosprey iyonizasyon kaynağı ile tanıtılır.
Thermo Tune Plus cihaz kontrol yazılımında iyonizasyon voltajını 4.000 volta, kılıf gazını ise beş volta ayarlayın. Benzer şekilde, kılcal damar sıcaklığını 150 dereceye, S-lensi %50'ye ayarlayın Tanımla düğmesini tıklatın ve çözümleyici menüsünde FTMS'yi seçin. Kütle aralığı alanını normale ayarlayın ve çözünürlük alanında 100,000'i seçin.
Tbmktürtürün tam olarak ayarlandığından emin olun. Scan aralıkları menüsünün altında, ilk kütle alanına 200 girin ve son kütle alanına 2,000 girin. Gözlenen kütle doğruluğunu daha da tanımladıktan sonra, toplam iyon kromatogramında geniş tepe boyunca sinyalin ortalamasını belirleyin.
Kitle spektrum görüntüleme penceresindeki raptiye simgesine sağ tıklayın ve görünüm spektrum listesini seçin. Aynı menüden ekran seçeneklerini seçin ve ardından ekran menüsündeki tüm zirveler kutuyu geçiştirin. Görüntüleme penceresini kapatmak için tamam düğmesini tıklatın.
Kitle spektrum görüntüleme penceresindeki raptiye simgesine tekrar tıklayın ve dışa aktarma panosunu tam kütleyi seçin. İlk çalışma sayfasının dışa aktarılan veri hücresi A1'i yeni Excel elektronik tablosuna yapıştırın ve el yazmasına göre devam edin. Doğru kütle tabanlı lipid tanımlamaları gerçekleştirmek için LIMSA yazılımını açın.
Ana menüden, spektrum türü menüsüaltında tepe listesini seçin. Kütle spektrometresi verilerinin elde edildiği polariteile karşılık gelecek pozitif modu veya negatif modu seçin. En yüksek tam genişlikte ve z penceresinin üzerinde, en yüksek bulgu için istediğiniz toplu arama penceresini girin.
Bu protokolde plazma fraksiyonunun LDL içeriği 30 ila 40 kilodalton beta levitinin yağışla daha da zenginleştirildi. 140, 80, 65, 60 ve 15 kilodaltonprotein bantlarının varlığı LDL'lerin apoproteinleri ile ilişkilidir.
Eksojen yağ asidi kaynakları olarak yumurta sarısı plazma ile kültürleri tamamlayan triklosan kaynaklı büyüme inhibisyonu üstesinden gelir. Benzer şekilde, zenginleştirilmiş yumurta sarısı LDL ile triklosan tedavi kültürlerin takviyesi büyüme geri. Ayrıca, yumurta sarısı LDLs eklenmesi daha önce karakterize S.aureus yağ asidi, auxotroph büyümesini destekler.
Pre-yağ asidi içeriği% 1 tripton suyu veya tavuk yumurtası sarısı LDL akış enjeksiyonu yüksek çözünürlüklü doğru kütle spektrometresi istihdam tarafından ölçüldü. Az miktarda serbest yağ asidi bulundu. Bol stafilokok aureus membran fosfolipidlerin Ortogonal parsiyel en az kareler ayrımcı analizi, işlenmemiş ve tavuk yumurtası sarısı LDL tedavi koşulları bir yağ asidi bileşimi ile, açık sınıf ayırma gösterdi.
Tavuk yumurtası sarısı LDLs zenginleştirme bakteriyel patojenler ve konak lipoproteinler arasındaki etkileşimleri araştırmak için karmaşık yağ asitleri ucuz bir kaynak sağlar. Lipid ekstrelerinin hazırlanmasında kullanılan kloroform ve metanol tehlikelidir. Lütfen bu reaktifleri kimyasal bir duman başlığında kullandığınızdan ve tüm atık akışlarını içerdiğinden emin olun.
