Dieses Protokoll bietet einen Rahmen für die Untersuchung der Einbeziehung von exogenen Fettsäuren aus komplexen Wirtsquellen in bakterielle Membranen, insbesondere staphylococcus aureus. Das Protokoll nutzt unvoreingenommene lipidomische Analysen und Lipoproteinpartikel, die aus Hühnereigelb isoliert sind, als wirtschaftliche Quelle komplexer Fettsäuren, um die Aufnahme von Fettsäure in bakterielle Lipide zu quantifizieren. Die hier beschriebenen Massenspektrometrietechniken bieten eine unvergleichliche Perspektive auf das Fettsäureprofil von Staphylococcus aureus Lipiden, können aber an die Untersuchung anderer bakterieller Membranen angepasst werden.
Bei der Ausführung dieses Protokolls ist darauf zu achten, dass bei jedem Fraktionierungsschritt der LDL-enthaltene Anteil identifiziert und beibehalten wird. Die Entfernung des Ammoniaksulfats aus der Plasmafraktion ist entscheidend für nachgeschaltete Anwendungen der LDLs. Bieten Sie ausreichend Platz in den Schläuchen und wechseln Sie das Wasser nach Bedarf, um eine effektive Dialyse zu ermöglichen.
Zu Beginn zwei Eigelbe zweimal mit 30 Millilitersterilphosphat gepufferter Kochchen waschen, um Restalbumin zu entfernen. Punktieren Sie die Vitelline-Membran mit einer sterilen Pipettenspitze und entleeren Sie den Inhalt der Membran in ein steriles 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr. Etwa 24 bis 30 Milliliter oder 17 Mol-Natriumchloridlösung bei pH-Wert sieben zum Eigelb geben und kräftig vermischen.
Dann legen Sie die Röhre auf einem Schaukel-Shaker, um bei vier Grad Celsius für 60 Minuten zu mischen. Zentrifugieren Sie die Eigelbverdünnung bei 10 Grad Celsius bei 10.000 mal g für 45 Minuten. Übertragen Sie die überstande Plasmafraktion in eine sterile 50 Milliliter konische Röhre, so dass die granulierte Fraktion hinter lässt.
Und wieder Zentrifuge. Mischen Sie zunächst die Plasmafraktion mit 40 Volumenprozent Ammoniumsulfat auf einem Schaukelschüttler oder einem ähnlichen Gerät bei vier Grad Celsius für 60 Minuten. Nach der Einstellung des pH-Wertes zentrieren Sie die Plasmafraktion bei vier Grad Celsius und 10.000 Zeit g für eine Dauer von 45 Minuten.
Entfernen Sie die obere halbfeste gelbe Fraktion in sieben Kilodalton Porengröße Dialyse-Schläuche. Geben Sie mindestens 25 % zusätzlichen Platz in den Schläuchen zur Verfügung, damit sie anschwellen kann. Legen Sie die Dialyseschläuche in drei Liter Reinstwasser, um über Nacht bei drei Grad Celsius zu dialysieren, um das Ammoniumsulfat zu entfernen.
Nach der Dialyse zentrieren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius, wie zuvor beschrieben. Entfernen Sie vorsichtig die obere, halbfeste gelbe Fraktion in ein steriles Rohr und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Nach der nächtlichen Inkubation der Kultur 500 Mikroliter in zwei sterile 250 Milliliter verwirrte Kolben mit 49,5 Millilitern 1%Tryptonbrühe übertragen.
Etwa vier Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bebrüten, um eine mittlere Phase zu erreichen. 100 Milliliter Kultur in 25 Milliliter-Schritten auf vier sterile 50-Milliliter-Zentrifugenrohre übertragen und die vier Röhren mit 10 000 mal g zentrifugieren, um die Zellen zu pellet. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Zellpellet in 750 Mikroliter 1%Tryptonbrühe wieder auf.
Kombinieren Sie die vier 750 Mikroliter-Zellsuspensionen in einem einzigen 15-Milliliter-Rohr. Und aliquot 350 Mikroliter der Zellsuspension in sechs sterile 1,5 Milliliter Zentrifugenröhren. Verwenden Sie eine Pipette, um 30 Mikroliter LDLs in das 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr zu geben, um eine gewünschte Endkonzentration von 5% zu erreichen und bei 37 Grad Celsius mit Schütteln für vier Stunden zu brüten.
Zentrifugieren Sie die Kulturen bei vier Grad Celsius bei 16.000 mal g für eine Dauer von zwei Minuten. Und die Zellpellets in 330 Mikroliter steriler Phosphat-gepufferter Saline zum Waschen wieder aufhängen. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal.
Zeichnen Sie das Gewicht der sechs Nasszellpellets auf, indem Sie das Gewicht des leeren Rohres subtrahieren. Fangen Sie die Zellpellets auf Trockeneis ein. Fügen Sie zunächst eine Kugel von 5 Millimeter Zirkonoxid-Perlen auf jedem Zellpellet.
Fügen Sie 740 Mikroliter 75%HPLC-Methanol, gekühlt auf minus 80 Grad Celsius, direkt in jede Röhre ein. Dann fügen Sie zwei Mikroliter von 50 Mikromolar Dimyristoylphosphatidylcholin als internen Standard. Legen Sie die Probe mit 1,5 Milliliter Zentrifugenrohren in einen verfügbaren Port auf einem Kugelmischer-Gewebehomogenisator.
Homogenisieren Sie die Proben bei niedriger Geschwindigkeit. Einstellung zwei bis drei für drei Minuten. Überprüfen Sie die Proben visuell auf Homogenität.
Wenn Zellklumpen sichtbar sind, fahren Sie mit der Homogenisierung im Aufzählungszeicheninblender in zwei Minutenschritten fort. Als nächstes fügen Sie 270 Mikroliter Chloroform zu jeder Probe in einer chemischen Rauchhaube hinzu. Wirbeln Sie die Proben 30 Minuten lang kräftig an.
Zentrifugieren Sie die Proben in einer Tischzentrifuge bis zu 30 Minuten bei mindestens 2.000 mal g. In der chemischen Rauchhaube sammeln Sie den monophasischen Überstand und übertragen Sie ihn in ein neues Reagenzglas, während Sie das Proteinpellet am Boden des Extraktionsrohrs sorgfältig vermeiden. Übertragen Sie die zuvor hergestellten verdünnten Lipidextrakte in eine entsprechende Autosampler-Durchstechflasche.
Für die Strömungsinjektions-basierte Analyse legen Sie die Autosampler-Durchstechflaschen in einen temperaturgesteuerten Autosampler eines HPLC-Systems, das in der Lage ist, Kapillarflussanwendungen zu nutzen. Richten Sie das HPLC-System entsprechend dem Manuskript ein. Das Eluent wird von der HPLC-Transferleitung zum Massenspektrometer durch eine Elektrospray-Ionisationsquelle eingeführt, die mit einer strömungsarmen 34-Spur-Metallnadel ausgestattet ist.
Stellen Sie in der Gerätesteuerungssoftware Thermo Tune Plus die Ionisationsspannung auf 4.000 Volt und das Mantelgas auf fünf ein. Legen Sie in ähnlicher Weise die Kapillartemperatur auf 150 Grad Celsius und die S-Linse auf 50 % fest. Klicken Sie im Menü "Analyzer" auf FTMS. Legen Sie das Massenbereichsfeld auf normal und im Auflösungsfeld 100 000 aus.
Stellen Sie sicher, dass der Scantyp auf "Voll" festgelegt ist. Geben Sie im Menü "Scanbereiche" 200 in das erste Massenfeld ein, und geben Sie 2 000 in das letzte Massenfeld ein. Nach weiterer Definition der beobachteten Massengenauigkeit, durchschnittlich das Signal über den breiten Peak im gesamten Ionenchromatogramm.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Thumbtack-Symbol im Anzeigefenster des Massenspektrums, und wählen Sie die Liste des Ansichtsspektrums aus. Wählen Sie im gleichen Menü die Anzeigeoptionen und dann alle Spitzen im Anzeigemenü um. Klicken Sie auf die Schaltfläche okay, um das Anzeigefenster zu schließen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut auf das Thumbtack-Symbol im Anzeigefenster des Massenspektrums, und wählen Sie die genaue Masse der Export-Zwischenablage aus. Fügen Sie die exportierte Datenzelle A1 des ersten Arbeitsblatts in die neue Excel-Tabelle ein, und fahren Sie entsprechend dem Manuskript fort. Um genaue massenbasierte Lipididentifikationen durchzuführen, öffnen Sie die LIMSA-Software.
Wählen Sie im Hauptmenü die Peak-Liste unter dem Menü "Spektrumtyp" aus. Wählen Sie den positiven Modus oder den negativen Modus aus, um der Polarität zu entsprechen, in der die Massenspektrometriedaten erfasst wurden. Geben Sie in der Spitzenbreite bei maximal ergehend und über dem Z-Fenster das gewünschte Massensuchfenster für die Spitzensuche ein.
In diesem Protokoll wurde der LDL-Gehalt der Plasmafraktion durch die Ausfällung der 30 bis 40 Kilodalton-Betalevitine weiter angereichert. Das Vorhandensein von Proteinbändern bei 140, 80, 65, 60 und 15 Kilodaltonkorreliert mit den Apoproteinen von LDLs. Die Behandlung mit Triclosan hemmt das Wachstum von Staph aureus in fettsäurefreiem Medium.
Während die Ergänzung von Kulturen mit Eigelbplasma als exogene Fettsäurequellen triclosan-induzierte Wachstumshemmung überwindet. In ähnlicher Weise, Supplementierung von Triclosan-behandelten Kulturen mit angereichertem Eigelb LDL stellt das Wachstum wieder her. Darüber hinaus unterstützt die Zugabe von Eigelb LDLs das Wachstum einer zuvor charakterisierten S.aureus-Fettsäure, Auxotroph.
Der Gehalt an Präfettsäure wurde in 1% Tryptonbrühe oder Hühnereigelb LDL unter Verwendung von Strömungsinjektion serategenauer Massenspektrometrie gemessen. Es wurden minimale Mengen an freier Fettsäure gefunden. Orthogonale partielle kleinste Quadrate diskriminant Analyse von reichlich Staph Aureus Membran Phospholipide zeigten klare Klassentrennung, mit einer Fettsäurezusammensetzung von unbehandelten und Hühnereigelb LDL behandelt Endes.
Die Anreicherung von LDLs aus Hühnereigelb bietet eine kostengünstige Quelle komplexer Fettsäuren zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Krankheitserregern und Wirtslipoproteinen. Chloroform und Methanol, das bei der Herstellung von Lipidextrakten verwendet wird, sind gefährlich. Bitte achten Sie darauf, diese Reagenzien in einer chemischen Rauchhaube zu verwenden und alle Abfallströme zu enthalten.
