Questo protocollo fornisce un quadro per lo studio dell'incorporazione di acidi grassi esogeni da fonti ospiti complesse nelle membrane batteriche, in particolare lo stafilococco aureo. Il protocollo utilizza l'analisi lipidomica imparziale e le particelle di lipoproteina isolate dai tuorli d'uovo di gallina come fonte economica di acidi grassi complessi per quantificare l'incorporazione di acidi grassi nei lipidi batterici. Le tecniche di spettrometria di massa descritte qui offrono una prospettiva impareggiabile del profilo degli acidi grassi dei lipidi stafilococco aureo, ma possono essere adattate per studiare altre membrane batteriche.
Quando si esegue questo protocollo, si deve fare attenzione che ogni fase di frazionamento identifichi e mantenga la frazione contenente LDL. La rimozione del solfato di ammoniaca dalla frazione plasmatica è fondamentale per le applicazioni a valle degli LDL. Fornire ampio spazio nei tubi e cambiare l'acqua in base alle esigenze per consentire un'efficace dialisi.
Per iniziare, lavare due tuorli d'uovo due volte con 30 millilitri di soluzione salina tamponata di fosfato sterile per rimuovere l'albumina residua. Forare la membrana vitellina con una punta sterile di pipetta e drenare il contenuto della membrana in un tubo di centrifuga conico sterile da 50 millilitri. Aggiungere circa 24-30 millilitri o 17 soluzione di cloruro di sodio molare a pH sette al tuorlo d'uovo e mescolare vigorosamente.
Quindi posizionare il tubo su uno shaker a dondolo per mescolare a quattro gradi Celsius per 60 minuti. Centrifuga la diluizione del tuorlo d'uovo a 10 gradi Celsius a 10.000 volte g per 45 minuti. Trasferire la frazione plasmatica supernatante in un tubo conico sterile da 50 millilitri, lasciandosi alle spalle la frazione granulare pelletata.
E centrifuga di nuovo. In primo luogo, mescolare la frazione plasmatica con 40 percento di solfato di ammonio in volume di massa su uno shaker a dondolo o un dispositivo simile a quattro gradi Celsius per 60 minuti. Dopo aver regolato il pH, centrifugare la frazione plasmatica a quattro gradi Celsius e 10.000 g di tempo per una durata di 45 minuti.
Rimuovere la frazione gialla semisolida superiore in tubi di dialisi di dimensioni dei pori di sette kilodalton. Fornire un minimo del 25% di spazio extra nel tubo per consentire il suo rigonfiamento. Posizionare i tubi di dialisi in tre litri di acqua ultrapura per dializzare durante la notte a tre gradi Celsius per rimuovere il solfato di ammonio.
Dopo la dialisi, centrifugare la soluzione a quattro gradi Celsius come descritto in precedenza. Rimuovere con cura la frazione gialla superiore semisolida in un tubo sterile e conservare a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna della coltura, trasferire 500 microlitri in due contenitori sterili sconcertati da 250 millilitri contenenti 49,5 millilitri di brodo di tripptone all'1%.
Incubare per circa quattro ore a 37 gradi Celsius con tremori per raggiungere la fase medio-lunga. Trasferire 100 millilitri di coltura in incrementi di 25 millilitri a quattro tubi sterili di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare i quattro tubi a 10.000 volte g per pellettare le cellule. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo ogni pellet cellulare in 750 microlitri di brodo di tripptone all'1%.
Unire le quattro sospensioni a celle a 750 microlitri in un unico tubo da 15 millilitri. E aliquote 350 microlitri della sospensione cellulare in sei tubi sterili di centrifuga da 1,5 millilitri. Utilizzare una pipetta per aggiungere 30 microlitri di LDL nel tubo di centrifuga da 1,5 millilitri per ottenere una concentrazione finale desiderata del 5% E incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento per quattro ore.
Centrifugare le colture a quattro gradi Celsius a 16.000 volte g per una durata di due minuti. E sospendere di nuovo i pellet cellulari in 330 microlitri di soluzione salina sterile tamponata da fosfati da lavare. Ripeti questo lavaggio ancora una volta.
Registrare il peso dei sei pellet di cellule bagnate sottraendo il peso del tubo vuoto. Snap congelare i pellet cellulari sul ghiaccio secco. Per prima cosa aggiungi una pallina di perline di ossido di zirconio da 5 millimetri sopra ogni pellet cellulare.
Aggiungere 740 microlitri di metanolo di grado HPLC 75% refrigerato a meno 80 gradi Celsius direttamente in ogni tubo. Quindi aggiungere due microlitri di 50 micromolare dimiristoil fosfatidilcolina come standard interno. Posizionare il campione contenente tubi di centrifuga da 1,5 millilitri in una porta disponibile su un omogeneizzatore di tessuto del frullatore di proiettili.
Omogeneizzare i campioni a bassa velocità. Impostare da due a tre per tre minuti. Ispezionare visivamente i campioni per l'omogeneità.
Se sono visibili grumi di celle, continuare l'omogeneizzazione nel frullatore di punti elenco con incrementi di due minuti. Aggiungere quindi 270 microlitri di cloroformio a ciascun campione in una cappa chimica. Vortice vigorosamente i campioni per 30 minuti.
Centrifugare i campioni in una centrifuga da banco per un massimo di 30 minuti ad un minimo di 2.000 volte g. Nella cappa aspirante chimica, raccogliere il supernatante monofasico e trasferirlo in una nuova provetta evitando accuratamente il pellet proteico nella parte inferiore del tubo di estrazione. Trasferire gli estratti lipidici diluiti precedentemente preparati su un apposito flaconcino autocampionatore.
Per l'analisi basata sull'iniezione di flusso, posizionare i flaconcini dell'autocampionatore in un autocampionatore a temperatura controllata di un sistema HPLC in grado di applicazioni di flusso capillare. Impostare il sistema HPLC in base al manoscritto. L'eluente viene introdotto dalla linea di trasferimento HPLC allo spettrometro di massa attraverso una sorgente di ionizzazione elettrospray dotata di un ago metallico a basso flusso calibro 34.
Nel software di controllo dello strumento Thermo Tune Plus, impostare la tensione di ionizzazione su 4.000 volt e gas di sheath su cinque. Analogamente, impostare la temperatura capillare su 150 gradi Celsius e l'obiettivo S sul 50%Fare clic sul pulsante definisci scansione e nel menu dell'analizzatore selezionare FTMS. Impostare il campo intervallo di massa su normale e nel campo risoluzione selezionare 100.000.
Verificare che il tipo di analisi sia impostato su completo. Nel menu intervalli di scansione immettere 200 nel primo campo di massa e immettere 2.000 nell'ultimo campo di massa. Dopo aver definito ulteriormente la precisione di massa osservata, media il segnale attraverso il picco ampio nel cromatogramma ionici totale.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della levetta nella finestra di visualizzazione dello spettro di massa e selezionare l'elenco dello spettro di visualizzazione. Dallo stesso menu, selezionate le opzioni di visualizzazione e quindi tutti i picchi attivano l'interruttore nel menu di visualizzazione. Fare clic sul pulsante ok per chiudere la finestra di visualizzazione.
Fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della levetta nella finestra di visualizzazione dello spettro di massa e selezionare la massa esatta degli Appunti di esportazione. Incollare la cella di dati esportata A1 del primo foglio di lavoro nel nuovo foglio di calcolo di Excel e procedere in base al manoscritto. Per eseguire accurate identificazioni lipidiche basate sulla massa, aprire il software LIMSA.
Dal menu principale, selezionare l'elenco dei picchi nel menu del tipo di spettro. Selezionare la modalità positiva o la modalità negativa per corrispondere alla polarità in cui sono stati acquisiti i dati della spettrometria di massa. Nella larghezza completa del picco a metà massima e sopra la finestra z, immettere la finestra di ricerca di massa desiderata per la ricerca del picco.
In questo protocollo, il contenuto di LDL della frazione plasmatica è stato ulteriormente arricchito dalla precipitazione delle levitine beta da 30 a 40 kilodalton. La presenza di bande proteiche a 140, 80, 65, 60 e 15 kilodaltoni è correlata con le apoproteine dei LDLs. Il trattamento con triclosan inibisce la crescita dell'aureo dello stafiloco nel mezzo privo di acidi grassi.
Mentre l'integrazione delle colture con plasma di tuorlo d'uovo come fonti di acidi grassi esogeni supera l'inibizione della crescita indotta da triclosan. Allo stesso modo, l'integrazione di colture trattate con triclosan con tuorlo d'uovo arricchito LDL ripristina la crescita. Inoltre, l'aggiunta di LDL al tuorlo d'uovo supporta la crescita di un acido grasso S.aureus precedentemente caratterizzato, auxotroph.
Il contenuto di acidi grassi pre-grassi è stato misurato in brodo di tripptone all'1% o tuorlo d'uovo di gallina LDL utilizzando una spettrometria di massa accurata ad alta risoluzione ad iniezione di flusso. Sono state trovate quantità minime di acido grasso libero. L'analisi discriminante dei meno quadrati parziali ortogonali di abbondanti fosfolipidi della membrana stafa aurea ha dimostrato una chiara separazione di classe, con una composizione di acidi grassi di condizioni non trattate e trattate con tuorlo d'uovo di gallina LDL.
L'arricchimento degli LDL dal tuorlo d'uovo di gallina fornisce una fonte economica di acidi grassi complessi per studiare le interazioni tra agenti patogeni batterici e lipoproteine ospiti. Il cloroformio e il metanolo utilizzati nella preparazione degli estratti lipidici sono pericolosi. Assicurarsi di utilizzare questi reagenti in una cappa aspirante chimica e contenere tutti i flussi di rifiuti.
