استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

تركز مجموعتنا البحثية بشكل أساسي على الحديث المتبادل بين السرطان والخلايا المناعية. نهدف إلى التحقيق في تأثير الآليات البيولوجية المختلفة على تطور سرطان الرأس والرقبة من خلال تعديل مناعة الورم. الغرض من هذا البروتوكول هو تقييم الغزو داخل المصفوفة خارج الخلية والتحديد المكاني لأنواع الخلايا المختلفة في سياق متعدد الطبقات.

تتمثل ميزة هذا البروتوكول في استخدام الفيرويات غير المتجانسة التي تضم نوعين من الخلايا غير الورمية ذات الصلة جنبا إلى جنب مع الخلايا السرطانية لتحليل الغزو باستخدام مصفوفة خارج الخلية تجاه كل من الغشاء الصغير الذي يسهل اختراقه ومحفزات الانجذاب الكيميائي. للبدء ، أضف الجسيمات النانوية المغناطيسية إلى تعليق الخلية واخلطها 10 مرات. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واخلطها 10 مرات لإعادة تعليق الخلايا.

ثم انقل جميع الخلايا واخلطها في أنبوب جديد للزراعة المشتركة ، وقم بتوزيع 100 ميكرولتر من الخلايا المزروعة المشتركة في كل بئر من لوحة التعلق المنخفضة للغاية. أدخل المجال المغناطيسي للمحرك الكروي أسفل اللوحة للحث على التجميع والتكوين الكروي ووضعه في الحاضنة لمدة ثلاث ساعات. باستخدام طرف سعة 200 ميكرولتر ، أضف 50 ميكرولترا من ECM إلى وسط غشاء صغير يسهل اختراقه مكون من 24 بئرا.

قم بإزالة الفقاعات بإبرة معقمة ، مع التأكد من أن المصفوفة تغطي سطح الغشاء بالتساوي. احتضان الغشاء لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية لتكوين الهلام. للبدء ، قم بإعداد ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد والغشاء الصغير الذي يسهل اختراقه المطلي بالمصفوفة خارج الخلية.

أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع ، مع 10٪ مصل بقري الجنين إلى الغرفة السفلية للغشاء الصغير الذي يسهل اختراقه كعامل جذب كيميائي. ثم قم بإزالة الوسط بعناية من الفيرويات غير المتجانسة المشكلة ، وأضف برفق 50 ميكرولترا من الوسط الطازج غير المكملات لكل بئر فوق الكروية. باستخدام مقص معقم ، قم بقص حافة طرف احتفاظ منخفض سعة 200 ميكرولتر واجمع الكروي ، جنبا إلى جنب مع 50 ميكرولتر من المتوسط.

ضع الكروي برفق فوق المصفوفة خارج الخلية. بعد ذلك ، أضف بعناية 150 ميكرولترا من المتوسط غير المكملة قطرة قطرة للوصول إلى الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 48 ساعة.

انقر فوق ملف في برنامج التحليل. حدد فتح ، ثم اختر الصورة وانقر فوق موافق. ثم انقر فوق تحليل ، متبوعا بتعيين القياسات لتحديد المنطقة والكثافة المتكاملة وعرض التسمية.

انقر فوق موافق. أخيرا انقر فوق تحليل ، ثم قياس. تمثل صور المجال الساطع توطين كرويا أو خلية ، تم تحديده بواسطة التكتلات الداكنة أو السوداء.

أظهرت صور الخلايا المختلفة تباينا في شدة التألق وكميته عبر صور مختلفة على طول المحور Z ، مما يشير إلى أنماط مختلفة من الانتشار والغزو بين الخلايا. باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، تم تراكب قنوات مختلفة لتصور أنماط التموضع أثناء الغزو. أشار تحليل الصور للنتائج التمثيلية المقدمة إلى أن الخلايا الوحيدة تغزو أولا ، تليها الخلايا الورمية ، والخلايا الليفية هي آخر الخلايا التي تغزو المصفوفة خارج الخلية.