هنا نقدم بروتوكولات لإعداد شرائح الدماغ الحادة التي تحتوي على نواة جينيكولات الجانبية والتحقيق الكهربائي فيزيولوجيا من الشبكية ودالة المشبك العصبي القشرية. تدخل محاور خلية العقدة الشبكية نواة جينيكال الجانبية البعيدة عن المدخلات القشرية. وهذا يسمح التحفيز منفصلة من الشبكية المصبك العصبي والقشرية، والتي لها خصائص وظيفية مختلفة جدا.
لبدء هذا الإجراء، وإعداد غرفتين شريحة، واحدة مليئة 100 ملليلتر من حل تشريح والآخر مع 100 ملليلتر من حل التسجيل. ضع القارضين في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، واحضر الحلول باستخدام الكاربونجن لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل التشريح. المقبل ملءقار من البلاستيك مع 250 ملليلتر من محلول تشريح الجليد الباردة القريبة، وفقاعات مع كاربوجين لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
ثم ملء طبق بيتري البلاستيك مع حل تشريح الباردة لتشريح الدماغ. ضع قطعة من ورق التصفية في غطاء طبق بيتري، وملأها بكمية صغيرة من محلول التشريح. في وقت لاحق يبرد غرفة تشريح من الهزاز.
قطع جلد الرأس من الcaudal إلى الأنف، والحفاظ على فتحها مع الأصابع لفضح الجمجمة. للحصول على forebrain، قطع أولا الجمجمة على طول خط الوسط الخلفي / الأمامي. ثم قطع مرتين من خلال خياطة الإكلال وخياطة لامدويد.
إزالة الجمجمة بين خياطة الإكلال وخياطة لامدويد لفضح المخ. قطع لمبة الشم، وفصل forebrain من منتصف النهر مع شفرة غرامة. إزالة الدماغ من الجمجمة مع ملعقة رقيقة، ووضعها على ورقة تصفية في غطاء طبق بيتري.
للحفاظ على سلامة المدخلات الحسية والقشرية إلى نواة الجينية الجانبية الظهرية في شريحة الدماغ ، افصل نصفي الكرة الأرضية مع قطع باساتجيتال بزاوية من ثلاث إلى خمس درجات. بعد ذلك تجفيف الطائرات الجانبي الوسيط من نصفي الكرة الأرضية من خلال وضعها على ورقة مرشح. ثم الغراء لهم على مرحلة القطع مع زاوية من 10 إلى 25 درجة من الطائرة الأفقية.
ضع المسرح في وسط علبة العازلة المعدنية، وصب بلطف بقية محلول تشريح الجليد البارد في صينية العازلة. تنفيذ هذه الخطوة بعناية، منذ صب من الصعب جدا قد إزالة الدماغ لصقها. حافظ بعد ذلك على علبة العازلة في الدرج المليء بالجليد للحفاظ على درجة الحرارة المنخفضة أثناء التشريح.
المقطع 250 ميكرومتر شرائح مع شفرة حلاقة بسرعة 0.1 ملليمتر في الثانية الواحدة وlitslit من ملليمتر واحد. نقل شرائح إلى غرفة عقد مليئة حل التشريح المؤكسج في 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا، ومن ثم السماح لشرائح لاسترداد في حل تسجيل في 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد الانتعاش، وإزالة غرفة الشريحة عقد من حمام الماء، والحفاظ على شرائح في درجة حرارة الغرفة حتى تستخدم في التجارب.
في هذا الإجراء، سحب ماصات تسجيل باستخدام الشعيرات الدموية الزجاج بوروسيليكات ومجرعة خيوط. سحب المقبل الماصات تحفيز باستخدام نفس البروتوكول، ولكن كسر طرف قليلا بعد سحب لزيادة القطر. في وقت لاحق ملء ماصات التسجيل مع محلول داخل الخلايا والcytin الحيوية، وملء الماصات تحفيز مع حل تسجيل.
ثم ضع الشرائح في غرفة التسجيل، و perfuse باستمرار لهم مع حل تسجيل المؤكسج في درجة حرارة الغرفة. تصور شرائح مع مجهر تستقيم مجهزة الأشعة تحت الحمراء 1 ديو التصوير المجهري الفيديو. تحقق من جميع الشرائح، وحدد تلك التي تعرض مساحات بصرية سليمة.
ضع ماصة التحفيز على الشريحة قبل ترقيع الخلية مع ماصة تسجيل. للتحقيق في نقاط الاشتباك العصبي الشبكية، ضع الماصات المحفزة مباشرة على الجهاز البصري حيث يتم تجميع ألياف محور عصبي من خلايا العقدة الشبكية. لتحليل نقاط الاشتباك العصبي الجيني القشرية، ضع القطب المحفز على النواة reticularis thalami، وهي rostroventrally المجاورة للنواة الجانبية الظهرية.
بمجرد أن تكون ماصة التسجيل مغمورة في حل التسجيل، قم بتطبيق خطوة من خمسة ميليفولت لمراقبة مقاومة الماصات. تعيين احتمال عقد إلى ميليفولت صفر، وإلغاء احتمال الإزاحة بحيث يكون التيار عقد هو picoampere صفر. الاقتراب من الخلية مع ماصة تسجيل في حين تطبيق الضغط الإيجابي.
عندما تكون الماصة على اتصال مباشر مع غشاء الخلية، والإفراج عن الضغط الإيجابي، وتعيين احتمال عقد إلى ناقص 70 ملليفولت. ثم تطبيق ضغط سلبي طفيف للسماح لغشاء الخلية إلى إرفاق ماصة الزجاج بحيث أشكال ختم gigaohm. تعويض السعة ماصة، وفتح الخلية عن طريق تطبيق نبضات الضغط السلبي.
للتحقيق في وظيفة متشابك، وتطبيق 0.1 مللي ثانية نبضات الحالية عن طريق ماصة التحفيز. مراقبة مقاومة السلسلة بشكل مستمر من خلال تطبيق خطوة من خمسة ميليفولت. ويمكن تقدير مقاومة سلسلة من قبل تقسيم خمسة ملليفولت على اتساع ذروة التيار أثار.
استخدم الخلايا التي تحتوي على مقاومة سلسلة أصغر من 20 ميجا أوهه لتحليلها. لوضع العلامات الحيوية، والحفاظ على تكوين الخلية الكاملة لمدة خمس دقائق على الأقل للسماح بانتشار biocytin في dendrites القاصي. بعد التسجيل، قم بإزالة الماصات بلطف من الخلية بحيث لا يتم تدمير سوما.
إعداد لوحة ثقافة 24 خلية جيدا. ملء كل بئر مع 300 ميكرولترات من 4٪ PFA. الحرص على عدم تلويث أي شيء مع PFA التي ستكون على اتصال مع شرائح ليتم تسجيلها.
نقل شرائح من غرفة التسجيل إلى لوحة PFA التي تحتوي على ماصة مطاطية، وإصلاحها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استبدل PFA مع برنامج تلفزيوني. الحفاظ على شرائح في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية للمعالجة في المستقبل.
لطخة الخلايا، وغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني جديد ثلاث مرات. حظر مواقع الربط غير المحددة عن طريق احتضان الشرائح في محلول الحجب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. ثم تجاهل حل الحجب ، واحتضان الشرائح مع streptavidin اليكسا 568 المخفف في حل الحجب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على شاكر المدارية.
في اليوم التالي، تخلص من محلول الأجسام المضادة، واغسل الشرائح ثلاث مرات مع PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. ثم يغسل شرائح مع ماء الصنبور قبل تصاعد. ضع الشرائح من ماوس واحد على شريحة زجاجية واحدة.
تأكد من وجود الخلايا الملطخة على السطح العلوي من الشرائح. تمتص الماء حول شرائح مع الأنسجة، ثم ترك شرائح لتجف لمدة 15 دقيقة تقريبا. تطبيق بعد ذلك على نقطتين من المتوسط تصاعد على كل شريحة، وجبل زلة غطاء على الشريحة دون إنتاج فقاعات الهواء.
تخزين الشرائح المسمى في أربع درجات مئوية بعد مشاهدتها مع المجهر confocal. تُظهر هذه الصورة IR-DIC سوما العصبون العصبية العصبية الجانبية النوكلية العصبية النيجية الجانبية الظهرية مع طرف من ماصة التصحيح. Biocytin تلطيخ تمكننا من الحصول على وجهة نظر من الخلايا العصبية المسجلة.
مختلفة عن interneurons، التي لديها مورفولوجيا القطبين، والخلايا العصبية التتابع والحنجرة الزجرية متعددة الأقطاب تحتوي على أكثر من ثلاثة التشعبات الأولية. ثم تم إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لخليوين تتابع المسمى بالcytin الحيوي ، مما يدل على بنية تشعيرية متناظرة. الحفاظ على مدخلات الشبكية geniculate ومدخلات اللوكيكولات القشرية في نفس شرائح الدماغ هي الأكثر أهمية في هذا البروتوكول.
بعد هذا الإجراء، يمكننا، على سبيل المثال، أيضا التحقيق في مدخلات مثبطات من نواة reticularis thalami على الخلايا العصبية النواة الجانبية الظهرية. تذكر أن ارتداء قفازات عند تحديد شرائح الدماغ مع PFA، كما PFA هو خطر.
