Hier stellen wir die Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern und die elektrophysiologische Untersuchung von Netzhautgenulate und kortikaler Genulate-Synapsenfunktion enthalten. Netzhautganglienzellaxone gelangen weit weg von den kortikalen Eingängen in den lateralen Geniculate-Kern. Dies ermöglicht die getrennten Stimulationen von Netzhautgenulate und kortikalen Geniculate-Synapsen, die sehr unterschiedliche funktionelle Eigenschaften haben.
Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zwei Scheibenkammern vor, eine gefüllt mit 100 Milliliter der Sezierlösung und die andere mit 100 Milliliter Aufnahmelösung. Die beiden Becher bei 37 Grad Celsius in ein Wasserbad geben und die Lösungen mit Carbogen mindestens 15 Minuten vor der Zerlegung blasen. Als nächstes füllen Sie einen Plastikbecher mit 250 Millilitern fast eiskalter Dissektionslösung und blasen Sie ihn vor Gebrauch mindestens 15 Minuten mit Carbogen.
Dann füllen Sie eine Kunststoff-Petrischale mit der kalten Dissektionslösung für die Hirnsektion. Legen Sie ein Stück Filterpapier in den Deckel der Petrischale und füllen Sie es mit einer kleinen Menge Vonsemitlösung. Anschließend die Sezierkammer des Vibratome abkühlen.
Schneiden Sie die Haut des Kopfes von kaudal zu nasal, und halten Sie es mit den Fingern geöffnet, um den Schädel zu belichten. Um das Vorhirn zu erhalten, schneiden Sie zuerst den Schädel entlang der hinteren/vorderen Mittellinie. Dann schneiden Sie zwei weitere Male durch die koronare Naht und Lambdoid Naht.
Entfernen Sie den Schädel zwischen der koronalen Naht und der Lambdoid-Naht, um das Großhirn freizulegen. Schneiden Sie die Olfaktor-Glühbirne, und trennen Sie das Vorderhirn vom Mittelhirn mit einer feinen Klinge. Entfernen Sie das Gehirn mit einem dünnen Spachtel aus dem Schädel und legen Sie es auf ein Filterpapier im Deckel der Petrischale.
Um die Integrität der sensorischen und kortikalen Eingänge in den dorsalen lateralen Geniculate-Kern in der Hirnscheibe zu erhalten, trennen Sie die beiden Hemisphären mit einem parasagittalen Schnitt in einem Winkel von drei bis fünf Grad. Anschließend trocknen Sie die medialen Seitenebenen der beiden Hemisphären, indem Sie sie auf ein Filterpapier legen. Dann kleben Sie sie auf die Schnittbühne mit einem Winkel von 10 bis 25 Grad von der horizontalen Ebene.
Legen Sie die Bühne in die Mitte der Metallpufferschale und gießen Sie den Rest der eiskalten Dissektionslösung vorsichtig in die Pufferschale. Führen Sie diesen Schritt sorgfältig aus, da das Gießen zu hart das eingefügte Gehirn entfernen könnte. Als nächstes halten Sie die Pufferschale in der eisgefüllten Schale, um die niedrige Temperatur während der Zerlegung zu halten.
Abschnitt 250-Mikrometer-Scheiben mit einer Rasierklinge mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Millimeterpro-Sekunde und einer Amplitude von einem Millimeter. Übertragen Sie die Scheiben für etwa 30 Minuten in die mit Sauerstoff gefüllte Sezierlösung bei 34 Grad Celsius und lassen Sie die Scheiben dann bei 34 Grad Celsius für weitere 30 Minuten erholen. Nach der Bergung die Scheibenhaltekammer aus dem Wasserbad entfernen und die Scheiben bei Raumtemperatur halten, bis sie in Experimenten verwendet werden.
Ziehen Sie bei diesem Verfahren die Aufnahmepipetten mit Borosilikatglaskapillaren und einem Filamentzieher. Ziehen Sie als nächstes die stimulierenden Pipetten mit dem gleichen Protokoll, aber brechen Sie die Spitze leicht nach dem Ziehen, um den Durchmesser zu erhöhen. Anschließend die Aufnahmepipetten mit intrazellulärer Lösung und Biocytin füllen und die stimulierenden Pipetten mit Aufnahmelösung füllen.
Legen Sie dann die Scheiben in die Aufnahmekammer und durchdringen Sie sie kontinuierlich mit sauerstoffhaltiger Aufnahmelösung bei Raumtemperatur. Visualisieren Sie die Scheiben mit einem aufrechten Mikroskop, das mit IR-DIC-Videomikroskopie ausgestattet ist. Überprüfen Sie alle Slices, und wählen Sie die Slices aus, die intakte Optiktrakte anzeigen.
Legen Sie die Stimulationspipette auf die Scheibe, bevor Sie die Zelle mit einer Aufnahmepipette flicken. Um die retinalen Genulate-Synapsen zu untersuchen, legen Sie die stimulierende Pipette direkt auf den Optiktrakt, wo die Axonfasern aus retinalen Ganglienzellen gebündelt sind. Um die kortikalen Geniculate-Synapsen zu analysieren, legen Sie die stimulierende Elektrode auf den Kern reticularis thalami, der rostroventral an den dorsalen lateralen Genulatenkern angrenzt.
Sobald die Aufnahmepipette in die Aufnahmelösung eingetaucht ist, wenden Sie einen Fünf-Millivolt-Schritt an, um den Pipettenwiderstand zu überwachen. Legen Sie das Haltepotential auf Null Millivolt fest, und brechen Sie das Offsetpotential ab, sodass der Haltestrom null Picoampere ist. Nähern Sie sich der Zelle mit einer Aufnahmepipette, während Sie positiven Druck ausüben.
Wenn die Pipette in direktem Kontakt mit der Zellmembran ist, lassen Sie den positiven Druck los und stellen Sie das Haltepotenzial auf minus 70 Millivolt ein. Dann einen leichten Unterdruck ausüben, damit sich die Zellmembran so an der Glaspipette befestigen kann, dass sich eine Gigaohm-Dichtung bildet. Kompensieren Sie die Pipettenkapazität und öffnen Sie die Zelle, indem Sie Unterdruckimpulse anwenden.
Um die synaptische Funktion zu untersuchen, wenden Sie 0,1 Millisekunden Stromimpulse über die Stimulationspipette an. Überwachen Sie den Serienwiderstand kontinuierlich, indem Sie einen Fünf-Millivolt-Schritt anwenden. Der Serienwiderstand kann geschätzt werden, indem fünf Millivolt durch die Spitzenamplitude des evozierten Stroms dividiert werden.
Verwenden Sie nur die Zellen mit einem Serienwiderstand kleiner als 20 Megaohm für die Analyse. Für die Biozytin-Etikettierung die Ganzzellkonfiguration mindestens fünf Minuten lang beibehalten, um die Diffusion von Biocytin in die distalen Dendriten zu ermöglichen. Entfernen Sie nach der Aufnahme vorsichtig die Pipette aus der Zelle, damit das Soma nicht zerstört wird.
Bereiten Sie eine 24-Well-Zellkulturplatte vor. Füllen Sie jeden gut mit 300 Mikroliter von 4%PFA. Achten Sie darauf, nichts mit PFA zu verunreinigen, das in Kontakt mit den zu erfassenden Scheiben ist.
Die Scheiben aus der Aufnahmekammer mit einer Gummipipette auf die PFA-haltige Platte übertragen und über Nacht fixieren. Ersetzen Sie am nächsten Tag die PFA durch PBS. Halten Sie die Scheiben in PBS bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verarbeitung.
Um die Zellen zu färben, waschen Sie die Scheiben mit frischen PBS dreimal. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie die Scheiben in der Blockierlösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker inkubieren. Dann entsorgen Sie die Blockierlösung und inkubieren Sie die Scheiben mit Streptavidin Alexa 568 in der Blockierlösung bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Orbital-Shaker verdünnt.
Entsorgen Sie am nächsten Tag die Antikörperlösung und waschen Sie die Scheiben dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker. Dann die Scheiben vor der Montage mit Leitungswasser waschen. Legen Sie die Scheiben von einer Maus auf eine Glasfolie.
Stellen Sie sicher, dass sich die gebeizten Zellen auf der Oberen Oberfläche der Scheiben befinden. Das Wasser um die Scheiben mit Geweben aufnehmen und die Scheiben dann ca. 15 Minuten trocknen lassen. Anschließend zwei Tropfen Montagemedium auf jede Scheibe auftragen und einen Deckelschlupf auf dem Schlitten montieren, ohne Luftblasen zu erzeugen.
Bewahren Sie die beschrifteten Scheiben bei vier Grad Celsius auf, nachdem Sie sie mit einem konfokalen Mikroskop betrachtet haben. Dieses IR-DIC-Bild zeigt das Soma eines dorsalen lateralen Genulate-Kernrelais-Neurons mit einer Spitze der Patchpipeette. Biocytin Färbung ermöglicht es uns, einen Blick auf das aufgezeichnete Neuron zu gewinnen.
Im Unterscheidet sich von Interneuronen, die eine bipolare Morphologie haben, haben Relaisneuronen multipolare dendritische Lauben, die mehr als drei primäre Dendriten enthalten. Anschließend wurde eine dreidimensionale Rekonstruktion eines biocytin-markierten Relaisneurons erzeugt, die eine radial symmetrische dendritische Architektur zeigt. Bewahren Sie die retinalen Geniculate-Eingänge und die kortikalen Geniculate-Eingänge in den gleichen Gehirnscheiben sind in diesem Protokoll am wichtigsten.
Nach diesem Verfahren können wir beispielsweise auch die Inhibitor-Eingänge aus dem Nukleus reticularis thalami auf dorsale laterale Geniculate-Neuronen untersuchen. Denken Sie daran, Handschuhe zu tragen, wenn Sie die Gehirnscheiben mit PFA fixieren, da PFA gefährlich ist.
