כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפות המכילות את גרעין הגניקולציה האופטיבי ואת החקירה האלקטרופיזיולוגית של תפקוד הגניקולציה של הרשתית וסינפסת הגניקולציה של קליפת המוח. אקסונים של תאי גנגליון רשתית נכנסים לגרעין הגניקולציה בצדדים הרחק מהתשומות קליפת המוח. זה מאפשר גירויים נפרדים של geniculate רשתית סינפסות geniculate קליפת המוח, אשר יש תכונות פונקציונליות שונות מאוד.
כדי להתחיל בהליך זה, להכין שני תאי פרוסה, אחד מלא 100 מיליליטר של פתרון הניתוח והשני עם 100 מיליליטר של פתרון הקלטה. מניחים את שתי הקוביות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, ובועה את הפתרונות עם קרבוגן לפחות 15 דקות לפני הניתוח. לאחר מכן מלא פלסטיק עם 250 מיליליטר של פתרון ניתוח כמעט קר כקרח, ובועה אותו עם קרבוגן לפחות 15 דקות לפני השימוש.
לאחר מכן מלאו צלחת פטרי מפלסטיק בתסמת הניתוח הקרה לניתוח המוח. מניחים פיסת נייר סינון במכסה של צלחת פטרי, וממלאים אותה בכמות קטנה של פתרון ניתוח. לאחר מכן לקרר את תא הניתוח של הרטט.
חותכים את העור של הראש מן caudal לאף, ולשמור אותו פתוח באצבעות כדי לחשוף את הגולגולת. כדי להשיג את קו החזית, ראשית לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע האחורי / החזיתי. ואז לחתוך פעמיים נוספות דרך התפר קורונטל תפר lambdoid.
הסר את הגולגולת בין התפר הכתר לתפר lambdoid לחשוף את המוח הגדול. חותכים את נורת הריח, ומפרידים את הקם מהבריין עם להב דק. מוציאים את המוח מהגולגולת עם מרית דקה, וממקם אותו על נייר סינון במכסה של צלחת פטרי.
כדי לשמר את שלמות התשומות החושיות והקליפתיות לגרעין הגניקולציה הרוחבי הגבי בפרוסת המוח, הפרד בין שתי ההמיספרות באמצעות חתך parasagittal בזווית של שלוש עד חמש מעלות. לאחר מכן לייבש את המישורים הצדדיים המדיאליים של שתי ההמיספרות על ידי הנחתם על נייר מסנן. ואז להדביק אותם על שלב החיתוך עם זווית של 10 עד 25 מעלות מן המישור האופקי.
מניחים את הבמה במרכז מגש חיץ המתכת, ויוצקים בעדינות את שאר תותח הניתוח הקר כקרח לתוך מגש החיץ. בצע שלב זה בזהירות, שכן שפיכת קשה מדי עלולה להסיר את המוח המודבק. לאחר מכן שמרו את מגש החיץ במגש מלא הקרח כדי לשמור על הטמפרטורה הנמוכה במהלך הניתוח.
חלק 250 מיקרומטר פרוסות עם סכין גילוח במהירות של 0.1 מילימטר לשנייה משרעת של מילימטר אחד. מעבירים את הפרוסות לתא ההחזקה המלא בתפיסת ניתוח מחומצן ב-34 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות, ואז מאפשרים לפרוסות להתאושש בתפיסת ההקלטה ב-34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. לאחר ההחלמה, מוציאים את תא החזקת הפרוסות מאמבט המים, ולשמור את הפרוסות בטמפרטורת החדר עד לשימוש בניסויים.
בהליך זה, למשוך את פיפטות ההקלטה באמצעות נימי זכוכית borosilicate ו puller נימים. לאחר מכן למשוך את פיפטים מגרה באמצעות אותו פרוטוקול, אבל לשבור את הקצה מעט לאחר משיכת כדי להגדיל את הקוטר. לאחר מכן למלא את פיפטי הקלטה עם פתרון תאי וביוצטין, ולמלא את פיפטות מגרה עם פתרון הקלטה.
לאחר מכן מניחים את הפרוסות בתא ההקלטה, ומבלבלים אותן ללא הרף בתפיסת הקלטה מחומצן בטמפרטורת החדר. דמיינו את הפרוסות במיקרוסקופ זקוף המצויד במיקרוסקופ וידאו IR-DIC. בדוק את כל הפרוסות ובחר את הפרוסות המציגות דרכי אופטיות שלמות.
מניחים את פיפטה גירוי על הפרוסה לפני תיקון התא עם פיפטה הקלטה. כדי לחקור את הסינפסות geniculate הרשתית, מניחים את פיפטה מגרה ישירות על המתיחה האופטית שבו סיבי אקסון מתאים גנגליון רשתית ארוזים. כדי לנתח את הסינפסות geniculate קליפת המוח, מניחים את האלקטרודה מגרה על הגרעין reticularis תלאמי, אשר rostroventrally סמוך לגרעין geniculate הגבי.
לאחר פיפיט ההקלטה הוא שקוע בתתב"א ההקלטה, להחיל צעד חמישה מילי וולט כדי לפקח על ההתנגדות פיפטה. הגדר את פוטנציאל האחזקה לאפס מילי-וולט ובטל את פוטנציאל ההיסט כך שזרם האחזקה יהיה אפס פיקומפר. לגשת לתא עם פיפטה הקלטה תוך הפעלת לחץ חיובי.
כאשר פיפטה הוא במגע ישיר עם קרום התא, לשחרר את הלחץ החיובי, ולהגדיר את פוטנציאל החזקה מינוס 70 מיליבולטים. לאחר מכן להחיל לחץ שלילי קל כדי לאפשר את קרום התא לצרף פיפטה זכוכית כך חותם gigaohm צורות. לפצות על קיבוליות פיפטה, ולפתוח את התא על ידי הפעלת פולסים לחץ שלילי.
כדי לחקור את הפונקציה הסינפטית, להחיל פולסים זרם 0.1 אלפית שנייה באמצעות פיפטה גירוי. נטר את התנגדות הסדרה באופן רציף על-ידי החלת צעד של חמישה מילי-וולט. ההתנגדות הסדרתית יכולה להיות מוערכת על ידי חלוקת חמישה מיליבולטים על ידי משרעת השיא של הזרם המעורר.
השתמש רק בתאים עם עמידות לסדרה הקטנה מ- 20 מגה-השם לצורך ניתוח. לתיוג ביוצטין, שמרו על תצורת התא כולו למשך חמש דקות לפחות כדי לאפשר פיזור של ביוצטין לדנדריטים הדיסטליים. לאחר ההקלטה, להסיר בעדינות את פיפטה מהתא, כך soma לא נהרס.
הכינו צלחת תרבות תאים של 24 בארות. מלאו כל באר ב-300 מיקרוליטרים של 4%PFA. יש לדאוג לא לזהם שום דבר עם PFA כי יהיה במגע עם פרוסות להיות מוקלט.
מעבירים את הפרוסות מתא ההקלטה לצלחת המכילה PFA עם פיפטה גומי, ולתקן אותם בן לילה. למחרת, החלף את PFA עם PBS. שמור את הפרוסות ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס לעיבוד עתידי.
כדי להכתים את התאים, לשטוף את הפרוסות עם PBS טרי שלוש פעמים. חסום אתרי קשירה לא ספציפיים על ידי דגירה של הפרוסות בתפיסת החסימה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי. ואז להשליך את פתרון החסימה, ולהדגר את הפרוסות עם סטרפטבידין Alexa 568 מדולל בתפיסת החסימה בארבע מעלות צלזיוס לילה על שייקר מסלולית.
למחרת, להשליך את פתרון הנוגדן, ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית. לאחר מכן לשטוף את הפרוסות עם מי ברז לפני ההרכבה. מניחים את הפרוסות מעכבר אחד על מגלשת זכוכית אחת.
ודאו שהתאים המוכתמים נמצאים על המשטח העליון של הפרוסות. סופגים את המים סביב הפרוסות עם רקמות, ולאחר מכן משאירים את הפרוסות להתייבש במשך כ 15 דקות. לאחר מכן להחיל שתי טיפות של מדיום הרכבה על כל פרוסה, ולהטמון להחליק כיסוי על השקופית מבלי לייצר בועות אוויר.
אחסן את הפרוסות המסותוויות בארבע מעלות צלזיוס לאחר הצגתן במיקרוסקופ קונפוקלי. תמונה זו IR-DIC מראה את הסכומה של נוירון ממסר גרעין geniculate הגבי עם קצה של פיפטה תיקון. כתמי ביוצטין מאפשרים לנו לקבל תצוגה של הנוירון המוקלט.
שונה מן interneurons, אשר יש מורפולוגיה דו קוטבית, נוירונים ממסר יש ארברים דנדריטי רב קוטבי המכיל יותר משלושה דנדריטים ראשוניים. שחזור תלת מימדי של נוירון ממסר שכותרתו ביוצטין נוצר אז, אשר מראה ארכיטקטורה דנדריטית סימטרית רדיוטית. לשמר את תשומות geniculate הרשתית ואת תשומות geniculate קליפת המוח באותן פרוסות המוח חשובים ביותר בפרוטוקול זה.
בעקבות הליך זה, אנו יכולים, למשל, גם לחקור את תשומות המעכבים מן הגרעין reticularis תלאמי על נוירונים גניקולציה גניקולציה משנית הגבית. זכור ללבוש כפפות בעת תיקון פרוסות המוח עם PFA, כמו PFA הוא מסוכן.
