Burada retinal ve kortikal genidilat sinaps fonksiyonunun lateral geniculate çekirdeğini içeren akut beyin dilimlerinin hazırlanması ve elektrofizyolojik inceleme için protokoller sürünüldü. Retinagangli hücreli aksonlar kortikal girişlerden uzak lateral geniculate çekirdeğine girerler. Bu retinal genicülat ve kortikal genicülat sinapsayrı uyarılar sağlar, hangi çok farklı fonksiyonel özelliklere sahip.
Bu yordamı başlatmak için, biri 100 mililitre diseksiyon çözeltisi, diğeri 100 mililitre kayıt çözeltisi ile dolu iki dilim odasını hazırlayın. 37 santigrat derece bir su banyosu içine iki gagaları yerleştirin ve diseksiyon önce en az 15 dakika carbogen ile çözeltikabarcık. Daha sonra plastik bir kabı 250 mililitre yakın buz gibi diseksiyon solüsyonu ile doldurun ve kullanmadan önce en az 15 dakika karbogen ile kabar.
Sonra beyin diseksiyonu için soğuk diseksiyon solüsyonu ile plastik bir Petri çanak doldurun. Petri kabının kapağına bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve az miktarda diseksiyon çözeltisi ile doldurun. Daha sonra vibratom diseksiyon odası aşağı soğutun.
Kaudaldan buruna kadar başın derisini kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için parmaklarla açık tutun. Ön beyin elde etmek için, ilk posterior / ön orta hat boyunca kafatası kesti. Sonra koronal sütür ve lambdoid sütür ile iki kez daha kesin.
Beyin ortaya çıkarmak için koronal sütür ve lambdoid sütür arasındaki kafatası çıkarın. Koku ampulü kesin ve ön beyni orta beyinden ince bir bıçakla ayırın. İnce bir spatula ile kafatasından beyin çıkarın ve Petri çanak kapağında bir filtre kağıt üzerine yerleştirin.
Beyin dilimindedsal lateral geniculate çekirdeğine duyusal ve kortikal girdilerin bütünlüğünü korumak için, üç ila beş derecelik bir açıyla bir parasagittal kesim ile iki yarımküreyi ayırın. Daha sonra bir filtre kağıda yerleştirerek iki yarımkürenin medial lateral düzlemleri kuru. Daha sonra yatay düzlemden 10 ila 25 derecelik bir açı ile kesme aşamasına yapıştırın.
Sahneyi metal tampon tepsisinin ortasına yerleştirin ve buz gibi diseksiyon çözeltisinin geri kalanını tampon tepsisine hafifçe dökün. Çok sert dökme yapıştırılan beyin kaldırabilir bu yana, dikkatle bu adımı gerçekleştirin. Daha sonra, diseksiyon sırasında düşük sıcaklığı korumak için tampon tepsiyi buz dolu tepside tutun.
Bölüm 250 mikrometre saniyede 0,1 milimetre ve bir milimetre genlik bir jilet ile dilimler. Dilimleri 34 santigrat derecede oksijenli diseksiyon solüsyonu ile dolu tutma odasına yaklaşık 30 dakika aktarın ve ardından dilimlerin 30 dakika daha 34 santigrat derecede kayıt çözeltisinde toparlanmasına izin verin. İyileştikten sonra, dilim tutma odasını su banyosundan çıkarın ve dilimleri deneylerde kullanılana kadar oda sıcaklığında tutun.
Bu işlemde, borosilikat cam kılcal damarlar ve bir filament puller kullanarak kayıt pipetleri çekin. Sonra aynı protokolü kullanarak uyarıcı pipetler çekin, ancak çapı artırmak için çektikten sonra biraz ucu kırmak. Daha sonra kayıt pipetleri hücre içi solüsyon ve biyositin ile doldurun ve uyarıcı pipetleri kayıt çözeltisi ile doldurun.
Daha sonra dilimleri kayıt odasına yerleştirin ve oda sıcaklığında oksijenli kayıt çözeltisi ile sürekli olarak perfitlendirin. IR-DIC video mikroskobu ile donatılmış dik bir mikroskop ile dilimleri görselleştirin. Tüm dilimleri kontrol edin ve sağlam optik yolları görüntüleyenleri seçin.
Bir kayıt pipet ile hücre yama önce dilim üzerinde stimülasyon pipet yerleştirin. Retinal geniculate sinapsları araştırmak için, uyarıcı pipeti doğrudan retinaganglion hücrelerinden akson liflerinin birleştiği optik sistem üzerine yerleştirin. Kortikal genikülat sinapsları analiz etmek için, uyarıcı elektrodu, dorsal lateral geniculate çekirdeğine bitişik olan çekirdek reticularis thalami üzerine yerleştirin.
Kayıt pipeti kayıt çözeltisine daldırıladıktan sonra pipet direncini izlemek için beş milivoltluk bir adım uygulayın. Tutma potansiyelini sıfır milivolta ayarlayın ve tutma akımının sıfır pikoampere olması için ofset potansiyelini iptal edin. Pozitif basınç uygularken bir kayıt pipet ile hücre yaklaşım.
Pipet hücre zarı ile doğrudan temas halinde olduğunda, pozitif basınç bırakın ve eksi 70 milivolt tutma potansiyelini ayarlayın. Sonra hücre zarının cam pipete böyle bir gigaohm mühür formları takmak için izin vermek için hafif negatif basınç uygulayın. Pipet kapasitansını dengeler ve negatif basınç darbeleri uygulayarak hücreyi açın.
Sinaptik fonksiyonu araştırmak için, stimülasyon pipeti ile 0.1 milisaniyelik akım darbeleri uygulayın. Beş milivoltluk bir adım uygulayarak seri direncini sürekli olarak izleyin. Seri direnci, beş milivoltun uyarılmış akımın en yüksek genliğine bölünmesiyle tahmin edilebilir.
Analiz için 20 megaohm'dan daha küçük bir seri direnci olan hücreleri kullanın. Biocytin etiketleme için, distal dendritler içine biyositdifüzyon sağlamak için en az beş dakika boyunca tüm hücre yapılandırmasını korumak. Kayıttan sonra pipeti hücreden yavaşça çıkarın, böylece soma yok olmaz.
24 kuyulu bir hücre kültür plakası hazırlayın. Her kuyuda %4 PFA'nın 300 mikrolitresini doldurun. Kaydedilecek dilimlerle temas edecek PFA ile hiçbir şeyi kirletmemeye özen.
Dilimleri kayıt odasından kauçuk pipetle PFA içeren tabağa aktarın ve bir gecede düzeltin. Ertesi gün, PfA'yı PBS ile değiştirin. Gelecekteki işlemler için pbs dilimleri dört santigrat derecede tutun.
Hücreleri lekelemek için dilimleri üç kez taze PBS ile yıkayın. Bir orbital shaker üzerinde oda sıcaklığında iki saat boyunca engelleme çözeltisi dilimleri kuluçka tarafından nonspesifik bağlama siteleri blok. Sonra engelleme çözeltisi atın ve streptavidin Alexa ile dilimleri kuluçka 568 bir orbital shaker bir gecede dört derece santigrat de engelleme çözeltisi seyreltilmiş.
Ertesi gün, antikor çözeltisi atın ve bir orbital shaker oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS ile dilimleri üç kez yıkayın. Daha sonra montajdan önce musluk suyu ile dilimleri yıkayın. Bir faredeki dilimleri bir cam slayta yerleştirin.
Lekeli hücrelerin dilimlerin üst yüzeyinde bulunduğundan emin olun. Dokular ile dilimleri etrafında su absorbe ve daha sonra yaklaşık 15 dakika kuru maya dilimleri bırakın. Daha sonra her dilime iki damla montaj ortamı uygulayın ve hava kabarcıkları üretmeden kaydırağa bir kapak fişi yerleştirin.
Etiketli dilimleri konfokal mikroskopla görüntüledikten sonra dört derece olarak saklayın. Bu IR-DIC görüntü yama pipet bir ucu ile bir dorsal lateral geniculate nükleus röle nöron soma gösterir. Biocytin boyama bize kaydedilen nöron bir görünüm elde etmenizi sağlar.
Bipolar morfolojisi olan internöronlardan farklı olarak, röle nöronlarında üçten fazla primer dendrit içeren multipolar dendritik arborlar vardır. Daha sonra biyositin etiketli röle nöronunun üç boyutlu rekonstrüksiyonu oluşturuldu, bu da radyal simetrik dendritik bir mimari gösteriyor. Retinajenik girdileri korumak ve aynı beyin dilimlerindeki kortikal jenik girdiler bu protokolde en önemli olanıdır.
Bu prosedürü takiben, biz de, örneğin, biz de dorsal lateral geniculate nükleus nöronlar üzerine çekirdek reticularis thalami inhibitör girdileri inceleyebilirsiniz. PFA tehlikeli olduğu gibi, PFA ile beyin dilimleri sabitleme eldiven giymeyi unutmayın.
