Aquí presentamos los protocolos para la preparación de rebanadas cerebrales agudas que contienen el núcleo geniculado lateral y la investigación electrofisiológica de la función de la geniculación retinical y la función de la sinapsis génica cortical. Los axones de células ganglionares retinulares entran en el núcleo geniculado lateral lejos de las entradas corticales. Esto permite las estimulaciones separadas de la geniculación retinal y las sinapsis génicas corticales, que tienen propiedades funcionales muy diferentes.
Para comenzar este procedimiento, prepare dos cámaras de corte, una llena con 100 mililitros de la solución de disección y la otra con 100 mililitros de solución de grabación. Coloque los dos vasos en un baño de agua a 37 grados centígrados y burbujee las soluciones con carbógeno durante al menos 15 minutos antes de la disección. A continuación, llene un vaso de precipitados de plástico con 250 mililitros de solución de disección casi helada y burlíllelo con carburógeno durante al menos 15 minutos antes de su uso.
A continuación, llene un plato de Petri de plástico con la solución de disección fría para la disección cerebral. Coloque un pedazo de papel de filtro en la tapa de la placa Petri y llénelo con una pequeña cantidad de solución de disección. Posteriormente enfríe la cámara de disección del vibratomo.
Corta la piel de la cabeza de caudal a nasal, y mantenla abierta con los dedos para exponer el cráneo. Para obtener el antebrao, primero corte el cráneo a lo largo de la línea media posterior/anterior. Luego corta dos veces más a través de la sutura coronal y la sutura lambdoid.
Retire el cráneo entre la sutura coronal y la sutura lambdoid para exponer el cerebro. Corte la bombilla olfativa y separe el antebrazado del cerebro medio con una hoja fina. Retire el cerebro del cráneo con una espátula delgada y colóquelo en un papel de filtro en la tapa de la placa de Petri.
Para preservar la integridad de las entradas sensoriales y corticales al núcleo geniculado lateral dorsal en la rebanada cerebral, separe los dos hemisferios con un corte parasagittal en un ángulo de tres a cinco grados. Después seque los planos laterales mediales de los dos hemisferios colocándolos en un papel de filtro. A continuación, pegarlos en la etapa de corte con un ángulo de 10 a 25 grados desde el plano horizontal.
Coloque el escenario en el centro de la bandeja de tampón de metal y vierta suavemente el resto de la solución de disección helada en la bandeja del tampón. Realice este paso con cuidado, ya que verter demasiado duro podría eliminar el cerebro pegado. A continuación, mantenga la bandeja de almacenamiento en la bandeja llena de hielo para mantener la baja temperatura durante la disección.
Sección 250-micromera rebanadas con una cuchilla de afeitar a una velocidad de 0,1 milímetros por segundo y una amplitud de un milímetro. Transfiera las rodajas a la cámara de retención llena de solución de disección oxigenada a 34 grados Celsius durante unos 30 minutos, y luego permita que las rodajas se recuperen en la solución de grabación a 34 grados celsius durante otros 30 minutos. Después de la recuperación, retire la cámara de retención de rodajas del baño de agua y mantenga las rodajas a temperatura ambiente hasta que se usen en experimentos.
En este procedimiento, tire de las pipetas de grabación utilizando capilares de vidrio borosilicato y un tirador de filamentos. A continuación, tire de las pipetas estimulantes utilizando el mismo protocolo, pero romper la punta ligeramente después de tirar para aumentar el diámetro. Posteriormente llenar las pipetas de grabación con solución intracelular y biocytina, y llenar las pipetas estimulantes con solución de grabación.
A continuación, coloque las rodajas en la cámara de grabación y perfugue continuamente con una solución de grabación oxigenada a temperatura ambiente. Visualice las rodajas con un microscopio vertical equipado con microscopía de vídeo IR-DIC. Compruebe todos los sectores y seleccione los que muestran los distritos ópticos intactos.
Coloque la pipeta de estimulación en la rebanada antes de parchear la celda con una pipeta de grabación. Para investigar las sinapsis génicas de la retina, coloque la pipeta estimulante directamente en el tracto óptico donde se agrupan las fibras de axón de las células ganglionares de la retina. Para analizar las sinapsis génicas corticales, coloque el electrodo estimulante en el núcleo reticularis thalami, que es rostroventrally adyacente al núcleo geniculado lateral dorsal.
Una vez que la pipeta de grabación esté sumergida en la solución de grabación, aplique un paso de cinco milivoltios para controlar la resistencia de la pipeta. Establezca el potencial de retención en cero milivoltios y cancele el potencial de desplazamiento para que la corriente de retención sea picoampere cero. Acérquese a la celda con una pipeta de grabación mientras aplica presión positiva.
Cuando la pipeta esté en contacto directo con la membrana celular, suelte la presión positiva y establezca el potencial de retención en menos 70 milivoltios. A continuación, aplique una ligera presión negativa para permitir que la membrana celular se adhille a la pipeta de vidrio de forma que se forme un sello de gigaohm. Compensar la capacitancia de la pipeta y abrir la celda aplicando pulsos de presión negativos.
Para investigar la función sináptica, aplique pulsos de corriente de 0,1 milisegundos a través de la pipeta de estimulación. Supervise la resistencia de la serie continuamente aplicando un paso de cinco milivoltios. La resistencia de la serie se puede estimar dividiendo cinco milivoltios por la amplitud máxima de la corriente evocada.
Utilice sólo las células con una resistencia en serie inferior a 20 megamios para el análisis. Para el etiquetado de biocitina, mantenga la configuración de células enteras durante al menos cinco minutos para permitir la difusión de la biocitina en las dendritas distales. Después de la grabación, retire suavemente la pipeta de la celda para que el soma no se destruya.
Prepare una placa de cultivo celular de 24 pozos. Llene cada pozo con 300 microlitros de 4%PFA. Tenga cuidado de no contaminar nada con PFA que esté en contacto con las rebanadas a registrar.
Transfiera las rodajas de la cámara de grabación a la placa que contiene PFA con una pipeta de goma y fíjelas durante la noche. Al día siguiente, reemplace el PFA por PBS. Mantenga las rodajas en PBS a cuatro grados centígrados para su procesamiento futuro.
Para manchar las células, lave las rodajas con PBS fresco tres veces. Bloquee los sitios de unión no específicos incubando las rodajas en la solución de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador orbital. A continuación, deseche la solución de bloqueo e incubar las rodajas con estreptavidina Alexa 568 diluida en la solución de bloqueo a cuatro grados Centígrados durante la noche en un agitador orbital.
Al día siguiente, deseche la solución de anticuerpos y lave las rodajas tres veces con PBS durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente en un agitador orbital. A continuación, lave las rodajas con agua del grifo antes de montar. Coloque las rodajas de un ratón en una diapositiva de vidrio.
Asegúrese de que las celdas manchadas estén presentes en la superficie superior de las rebanadas. Absorba el agua alrededor de las rodajas con pañuelos de papel, y luego deja que las rodajas se sequen durante aproximadamente 15 minutos. Posteriormente aplicar dos gotas de medio de montaje en cada rebanada, y montar un resbalón de cubierta en el portaobjetos sin producir burbujas de aire.
Almacene las rodajas etiquetadas a cuatro grados centígrados después de verlas con un microscopio confocal. Esta imagen IR-DIC muestra el soma de una neurona dorsal de relé de núcleo geniculado lateral con una punta de la pipeta de parche. La tinción de biocitina nos permite obtener una visión de la neurona registrada.
A diferencia de las interneurones, que tienen morfología bipolar, las neuronas de relé tienen árboles dendríticos multipolar que contienen más de tres dendritas primarias. Luego se generó la reconstrucción tridimensional de una neurona de relé etiquetada con biocitina, que muestra una arquitectura dendrítica radialmente simétrica. Conservar los insumos de geniculación de la retina y las entradas de geniculación cortical en las mismas rebanadas cerebrales son más importantes en este protocolo.
Después de este procedimiento, podemos, por ejemplo, también investigar las entradas inhibidoras del núcleo reticularis thalami en las neuronas dorsales del núcleo geniculado. Recuerde usar guantes al fijar las rebanadas cerebrales con PFA, ya que la PFA es peligrosa.
