Ici nous présentons les protocoles pour la préparation des tranches aiguës de cerveau contenant le noyau latéral de geniculate et l’investigation électrophysiologique du geniculate rétinien et de la fonction corticale de synapse de geniculate. Les axones rétiniens de cellules de ganglion entrent dans le noyau latéral de geniculate loin des entrées corticales. Cela permet les stimulations séparées du geniculate rétinien et des synapses corticales de geniculate, qui ont des propriétés fonctionnelles très différentes.
Pour commencer cette procédure, préparer deux chambres de tranche, l’une remplie de 100 millilitres de la solution de dissection et l’autre avec 100 millilitres de solution d’enregistrement. Placez les deux beakers dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius, et bullez les solutions avec du carbogen pendant au moins 15 minutes avant la dissection. Remplissez ensuite un bécher en plastique de 250 millilitres de solution de dissection presque glacée et bouillonnez-le de carbogen pendant au moins 15 minutes avant l’utilisation.
Remplissez ensuite une boîte de Pétri en plastique avec la solution de dissection froide pour la dissection du cerveau. Placez un morceau de papier filtre dans le couvercle de la boîte de Pétri et remplissez-le d’une petite quantité de solution de dissection. Refroidissez ensuite la chambre de dissection du vibratome.
Couper la peau de la tête de caudale à nasale, et le garder ouvert avec les doigts pour exposer le crâne. Pour obtenir le cerveau antérieur, coupez d’abord le crâne le long de la ligne médiane postérieure/antérieure. Ensuite, couper deux fois de plus à travers la suture coronale et suture lambdoid.
Retirez le crâne entre la suture coronale et la suture lambdoid pour exposer le cerveau. Couper l’ampoule olfactive et séparer le cerveau antérieur du cerveau moyen à l’aide d’une fine lame. Retirez le cerveau du crâne à l’aide d’une fine spatule et placez-le sur un papier filtre dans le couvercle de la boîte de Pétri.
Pour préserver l’intégrité des apports sensoriels et corticals du noyau latéral dorsale de geniculate dans la tranche de cerveau, séparez les deux hémisphères avec une coupe parasagittale à un angle de trois à cinq degrés. Ensuite, séchez les plans latéraux médiaux des deux hémisphères en les plaçant sur un papier filtre. Collez-les ensuite sur la scène de coupe avec un angle de 10 à 25 degrés du plan horizontal.
Placez la scène au centre du plateau tampon métallique et versez doucement le reste de la solution de dissection glacée dans le bac tampon. Effectuez cette étape avec soin, car verser trop fort pourrait enlever le cerveau passé. Ensuite, gardez le plateau tampon dans le plateau rempli de glace pour maintenir la basse température pendant la dissection.
Tranches de la section 250 micromètres avec une lame de rasoir à une vitesse de 0,1 millimètre par seconde et une amplitude d’un millimètre. Transférer les tranches dans la chambre de détention remplies de solution de dissection oxygénée à 34 degrés Celsius pendant environ 30 minutes, puis laisser les tranches récupérer dans la solution d’enregistrement à 34 degrés Celsius pendant encore 30 minutes. Après la récupération, retirer la chambre de fixation des tranches du bain d’eau et conserver les tranches à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient utilisées dans des expériences.
Dans cette procédure, tirez les pipettes d’enregistrement à l’aide de capillaires en verre borosilicate et d’un puller filament. Tirez ensuite les pipettes stimulantes en utilisant le même protocole, mais casser légèrement la pointe après avoir tiré pour augmenter le diamètre. Remplissez ensuite les pipettes d’enregistrement avec la solution intracellulaire et la biocytine, et remplissez les pipettes stimulantes avec la solution d’enregistrement.
Placez ensuite les tranches dans la chambre d’enregistrement et imprènuez-les continuellement avec une solution d’enregistrement oxygénée à température ambiante. Visualisez les tranches à l’aide d’un microscope droit équipé d’une microscopie vidéo IR-DIC. Vérifiez toutes les tranches et sélectionnez ceux qui affichent des tractus optiques intacts.
Placez la pipette de stimulation sur la tranche avant de patcher la cellule avec une pipette d’enregistrement. Pour étudier les synapses geniculate rétiniennes, placez la pipette stimulante directement sur le tractus optique où les fibres d’axon des cellules rétiniennes de ganglion sont empaquetées. Pour analyser les synapses corticales de geniculate, placez l’électrode stimulante sur le noyau reticularis thalami, qui est rostroventrally adjacent au noyau latéral dorsale de geniculate.
Une fois que la pipette d’enregistrement est immergée dans la solution d’enregistrement, appliquez une étape de cinq millivolts pour surveiller la résistance de pipette. Réglez le potentiel de détention à zéro millivolt, et annuler le potentiel de compensation de sorte que le courant de détention est zéro picoampere. Approchez la cellule avec une pipette d’enregistrement tout en appliquant une pression positive.
Lorsque la pipette est en contact direct avec la membrane cellulaire, relâchez la pression positive et réglez le potentiel de détention à moins 70 millivolts. Appliquez ensuite une légère pression négative pour permettre à la membrane cellulaire de se fixer à la pipette en verre de telle sorte qu’un joint gigaohm se forme. Compensez la capacitance pipette et ouvrez la cellule en appliquant des impulsions de pression négatives.
Pour étudier la fonction synaptique, appliquez des impulsions de courant de 0,1 milliseconde par l’intermédiaire de la pipette de stimulation. Surveillez la résistance de la série en continu en appliquant une étape de cinq millivolts. La résistance en série peut être estimée en divisant cinq millivolts par l’amplitude maximale du courant évoqué.
N’utilisez que les cellules avec une résistance de série inférieure à 20 mégaohms pour l’analyse. Pour l’étiquetage de la biocytine, maintenez la configuration des cellules entières pendant au moins cinq minutes pour permettre la diffusion de la biocytine dans les dendrites distals. Après l’enregistrement, retirez doucement la pipette de la cellule afin que le soma ne soit pas détruit.
Préparer une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Remplissez chaque puits de 300 microlitres de 4 % de PFA. Prenez soin de ne pas contaminer quoi que ce soit avec pfa qui sera en contact avec les tranches à enregistrer.
Transférez les tranches de la chambre d’enregistrement à la plaque contenant de la PFA à l’aide d’une pipette en caoutchouc et fixez-les pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le PFA par PBS. Gardez les tranches dans PBS à quatre degrés Celsius pour le traitement futur.
Pour tacher les cellules, lavez les tranches avec du PBS frais trois fois. Bloquez les sites de liaison non spécifiques en incubant les tranches de la solution de blocage pendant deux heures à température ambiante sur un shaker orbital. Puis jeter la solution de blocage, et incuber les tranches avec de la streptavidine Alexa 568 dilué dans la solution de blocage à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un shaker orbital.
Le lendemain, jetez la solution d’anticorps et lavez les tranches trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacune à température ambiante sur un shaker orbital. Lavez ensuite les tranches avec de l’eau du robinet avant de monter. Déposer les tranches d’une souris sur une glissière en verre.
Assurez-vous que les cellules tachées sont présentes sur la surface supérieure des tranches. Absorber l’eau autour des tranches avec des tissus, puis laisser sécher les tranches pendant environ 15 minutes. Appliquez ensuite deux gouttes de milieu de montage sur chaque tranche, et montez un glissement de couverture sur la glissière sans produire de bulles d’air.
Conservez les tranches étiquetées à quatre degrés Celsius après les avoir visionnées au microscope confocal. Cette image IR-DIC montre le soma d’un noyau geniculate latéral dorsal relayant le neurone avec une pointe de la pipette de correction. La coloration biocytine nous permet d’avoir une vue du neurone enregistré.
Différents des interneurones, qui ont une morphologie bipolaire, les neurones relais ont des tonnelles dendritiques multipolaires contenant plus de trois dendrites primaires. La reconstruction tridimensionnelle d’un neurone relais biocytine-étiqueté a été alors produite, qui montre une architecture dendritique radialement symétrique. Préserver les entrées rétiniennes de geniculate et les entrées corticales de geniculate dans les mêmes tranches de cerveau sont les plus importantes dans ce protocole.
Après cette procédure, nous pouvons, par exemple, également étudier les entrées d’inhibiteur du noyau reticularis thalami sur les neurones du noyau geniculate latéral dorsal. N’oubliez pas de porter des gants lors de la fixation des tranches de cerveau avec PFA, comme PFA est dangereux.
