Qui presentiamo i protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo geniculato laterale e l'indagine elettrofisiologia del genicolo retinico e della funzione sinapsi genicolata corticale. Gli assoni delle cellule gangliari retiniche entrano nel nucleo geniculato laterale lontano dagli ingressi corticali. Ciò consente le stimolazioni separate del geniculato retinale e delle sinapsi genicolate corticali, che hanno proprietà funzionali molto diverse.
Per iniziare questa procedura, preparare due camere a fette, una riempita con 100 millilitri della soluzione di dissezione e l'altra con 100 millilitri di soluzione di registrazione. Mettere i due becher in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e far bollire le soluzioni con carbogeno per almeno 15 minuti prima della dissezione. Quindi riempire un becher di plastica con 250 millilitri di soluzione di dissezione quasi ghiacciata e bollarlo con carbogeno per almeno 15 minuti prima dell'uso.
Quindi riempire una piastra di Petri di plastica con la soluzione di dissezione fredda per la dissezione cerebrale. Posizionare un pezzo di carta da filtro nel coperchio della piastra di Petri e riempirlo con una piccola quantità di soluzione di dissezione. Successivamente raffreddare la camera di dissezione del vibratoma.
Tagliare la pelle della testa dal caudale alla nasale e tenerla aperta con le dita per esporre il cranio. Per ottenere il forebrain, tagliare prima il cranio lungo la linea mediana posteriore/anteriore. Quindi tagliare altre due volte attraverso la sutura coronale e la sutura lambdoide.
Rimuovere il cranio tra la sutura coronale e la sutura lambdoide per esporre il cerebro. Tagliare il bulbo olfattivo e separare il forebrain dal cervello medio con una lama fine. Rimuovere il cervello dal cranio con una spatola sottile e posizionarlo su una carta da filtro nel coperchio della piastra di Petri.
Per preservare l'integrità degli input sensoriali e corticali al nucleo geniculato laterale dorsale nella fetta cerebrale, separare i due emisferi con un taglio parasagittale con un angolo di tre-cinque gradi. Successivamente asciugare i piani laterale mediali dei due emisferi posizionandoli su una carta da filtro. Quindi incollali sullo stadio di taglio con un angolo da 10 a 25 gradi dal piano orizzontale.
Posizionare lo stadio al centro del vassoio tampone metallico e versare delicatamente il resto della soluzione di dissezione ghiacciata nel vassoio tampone. Eseguire questo passaggio con attenzione, poiché versare troppo duramente potrebbe rimuovere il cervello incollato. Quindi mantenere il vassoio tampone nel vassoio pieno di ghiaccio per mantenere la bassa temperatura durante la dissezione.
Sezione 250-micrometro fette con una lama rasoio ad una velocità di 0,1 millimetri al secondo e un'ampiezza di un millimetro. Trasferire le fette nella camera di tenuta riempita con soluzione di dissezione ossigenata a 34 gradi Celsius per circa 30 minuti, quindi lasciare che le fette si riprendano nella soluzione di registrazione a 34 gradi Celsius per altri 30 minuti. Dopo il recupero, rimuovere la camera di tenuta delle fette dal bagno d'acqua e mantenere le fette a temperatura ambiente fino a quando non viene utilizzata negli esperimenti.
In questa procedura, tirare le pipette di registrazione utilizzando capillari di vetro borosilicato e un estrattore di filamento. Quindi tirare le pipette stimolanti utilizzando lo stesso protocollo, ma rompere leggermente la punta dopo aver tirato per aumentare il diametro. Successivamente riempire le pipette di registrazione con soluzione intracellulare e biocitina e riempire le pipette stimolanti con soluzione di registrazione.
Quindi posizionare le fette nella camera di registrazione e perfonderle continuamente con una soluzione di registrazione ossigenata a temperatura ambiente. Visualizza le fette con un microscopio verticale dotato di microscopia video IR-DIC. Controllare tutte le fette e selezionare quelle che visualizzano tratti ottici intatti.
Posizionare la pipetta di stimolazione sulla fetta prima di rattoppare la cella con una pipetta di registrazione. Per indagare le sinapsi genicolate retiniche, posizionare la pipetta stimolante direttamente sul tratto ottico dove sono raggruppate le fibre di assone provenienti dalle cellule gangliari retiniche. Per analizzare le sinapsi genicolate corticali, posizionare l'elettrodo stimolante sul nucleo reticolare thalami, che è rostroventralmente adiacente al nucleo geniculato laterale dorsale.
Una volta che la pipetta di registrazione è immersa nella soluzione di registrazione, applicare un passo di cinque millivolt per monitorare la resistenza della pipetta. Impostate il potenziale di tenuta su zero millivolt e annullate il potenziale di offset in modo che la corrente di tenuta sia zero picoampere. Avvicinati alla cella con una pipetta di registrazione mentre applichi una pressione positiva.
Quando la pipetta è a diretto contatto con la membrana cellulare, rilasciare la pressione positiva e impostare il potenziale di tenuta a meno 70 millivolt. Quindi applicare una leggera pressione negativa per consentire alla membrana cellulare di attaccarsi alla pipetta di vetro in modo tale che si forma una guarnizione gigaohm. Compensate la capacità della pipetta e aprite la cella applicando impulsi di pressione negativi.
Per studiare la funzione sinaptica, applicare impulsi di corrente di 0,1 millisecondi tramite la pipetta di stimolazione. Monitorare continuamente la resistenza della serie applicando un passo di cinque millivolt. La resistenza della serie può essere stimata dividendo cinque millivolt per l'ampiezza di picco della corrente evocata.
Utilizzare solo le celle con una resistenza in serie inferiore a 20 megaohms per l'analisi. Per l'etichettatura della biocitina, mantenere la configurazione a cellule intere per almeno cinque minuti per consentire la diffusione della biocitina nei dendriti distale. Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dalla cella in modo che il soma non venga distrutto.
Preparare una piastra di coltura cellulare di 24 po '. Riempire ogni bene con 300 microlitri del 4%PFA. Fare attenzione a non contaminare nulla con PFA che sarà a contatto con le fette da registrare.
Trasferire le fette dalla camera di registrazione alla piastra contenente PFA con una pipetta di gomma e fissarle durante la notte. Il giorno dopo, sostituire il PFA con PBS. Mantenere le sezioni in PBS a quattro gradi Celsius per l'elaborazione futura.
Per macchiare le cellule, lavare le fette con PBS fresco tre volte. Bloccare i siti di legame aspecifici incubando le fette nella soluzione di blocco per due ore a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Quindi scartare la soluzione di blocco e incubare le fette con streptavidina Alexa 568 diluita nella soluzione di blocco a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker orbitale.
Il giorno successivo, scartare la soluzione anticorpale e lavare le fette tre volte con PBS per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Quindi lavare le fette con acqua del rubinetto prima del montaggio. Posizionare le fette di un mouse su uno scivolo di vetro.
Assicurarsi che le celle macchiate siano presenti sulla superficie superiore delle fette. Assorbire l'acqua intorno alle fette con i tessuti, quindi lasciare asciugare le fette per circa 15 minuti. Successivamente applicare due gocce di mezzo di montaggio su ogni fetta e montare uno scivolo di copertura sullo scivolo senza produrre bolle d'aria.
Conservare le sezioni etichettate a quattro gradi Celsius dopo averle visualizzate con un microscopio confocale. Questa immagine IR-DIC mostra il soma di un neurone relè del nucleo geniculato laterale dorsale con una punta della pipetta patch. La colorazione della biocitina ci permette di avere una visione del neurone registrato.
Diversi dagli internaurioni, che hanno morfologia bipolare, i neuroni relè hanno pergolati dendritici multipolari contenenti più di tre dendriti primari. È stata quindi generata la ricostruzione tridimensionale di un neurone relè etichettato biocitina, che mostra un'architettura dendritica radialmente simmetrica. Mantieni gli input geniculati retinali e gli input geniculati corticali nelle stesse fette cerebrali sono più importanti in questo protocollo.
Seguendo questa procedura, possiamo, ad esempio, studiare anche gli input inibitori dal nucleo reticolare thalami sui neuroni del nucleo geniculato laterale dorsale. Ricordarsi di indossare guanti quando si riparano le fette cerebrali con PFA, poiché la PFA è pericolosa.
