Здесь мы представляем протоколы для подготовки острых ломтиков мозга, содержащих боковое геникуляционное ядро и электрофизиологическое исследование геникуля сетчатки и корковой гениальной функции синапса. Аксоны клеток сетчатки входят в боковое гениническое ядро вдали от корковых входов. Это позволяет проводить отдельные стимуляции генигенулировать сетчатку и корковые гениальные синапсы, которые имеют очень разные функциональные свойства.
Для начала этой процедуры приготовьте две срезные камеры, одна из них заполнена 100 миллилитров раствора вскрытия, а другая - 100 миллилитров записывающего раствора. Поместите два стакана в водяную баню при 37 градусах по Цельсию и пузырь растворов карбогеном, по крайней мере за 15 минут до вскрытия. Затем заполните пластиковый стакан 250 миллилитров почти ледяного раствора для вскрытия, и пузырь его карбогеном, по крайней мере 15 минут до использования.
Затем заполните пластиковую чашку Петри холодным раствором вскрытия для вскрытия мозга. Поместите кусок фильтровальной бумаги в крышку чашки Петри и заполните ее небольшим количеством раствора для вскрытия. Впоследствии охладить камеру вскрытия вибромы.
Отрежьте кожу головы от хвоста до носа, и держите ее открытой пальцами, чтобы разоблачить череп. Чтобы получить передний мозг, сначала вырезать череп вдоль задней / передней средней линии. Затем вырезать еще два раза через корональной швы и овсяные швы.
Удалите череп между корональной шов и овсяный шов, чтобы разоблачить головной мозг. Вырезать обонятельную луковицу, и отделить forebrain от среднего браина с тонкой лезвием. Снимите мозг с черепа тонким шпателем и поместите его на фильтровальную бумагу в крышку чашки Петри.
Чтобы сохранить целостность сенсорных и корковых входов в спинное боковое гениальное ядро в срезе мозга, отделить два полушария с паразагиттальным разрезом под углом от трех до пяти градусов. После этого высушите медиальные боковой плоскости двух полушарий, поместив их на фильтровальную бумагу. Затем приклейте их на режущей сцене с углом от 10 до 25 градусов от горизонтальной плоскости.
Поместите сцену в центр металлического буферного лотка и аккуратно вылейте остальную часть ледяного раствора для вскрытия в буферный лоток. Выполните этот шаг тщательно, так как заливка слишком сильно может удалить вать мозг. Затем держите буферный лоток в заполненном льдом лотке для поддержания низкой температуры во время вскрытия.
Раздел 250-микрометр ломтиками с лезвием бритвы со скоростью 0,1 миллиметра в секунду и амплитудой одного миллиметра. Перенесите ломтики в камеру холдинга, наполненную кислородным раствором для вскрытия при 34 градусах по Цельсию в течение примерно 30 минут, а затем позвольте ломтикам восстановиться в записывающем растворе при 34 градусах По Цельсию еще на 30 минут. После восстановления, удалить ломтик-держать камеру из водяной бани, и держать ломтики при комнатной температуре до тех пор, пока используется в экспериментах.
В этой процедуре, вытяните записи пипетки с помощью борозиликатных стеклянных капилляров и нити шкив. Далее потяните стимулирующие пипетки, используя тот же протокол, но немного сломайте кончик после вытягивания, чтобы увеличить диаметр. Впоследствии заполните записывающие пипетки внутриклеточным раствором и биоцитином, а также заполните стимулирующие пипетки раствором записи.
Затем поместите ломтики в камеру записи и непрерывно пронизываем их кислородным раствором записи при комнатной температуре. Визуализуй ломтики с помощью вертикального микроскопа, оснащенного видеоскопией IR-DIC. Проверьте все ломтики, и выберите те, которые отображают нетронутыми оптических путей.
Поместите стимуляцию пипетки на ломтик, прежде чем патч ячейки с записью пипетки. Чтобы исследовать гениальные синапсы сетчатки, поместите стимулирующую пипетку непосредственно на оптический тракт, где в комплекте находятся аксионные волокна клеток ганглия сетчатки. Для анализа корковых гениальных синапсов поместите стимулирующий электрод на ядро reticularis thalami, которое rostroventrally примыкает к спинной боковой геникулярного ядра.
После того, как записывающая пипетка погружается в записывающий раствор, нанесите пятимилитровый шаг для мониторинга сопротивления пипетки. Установите потенциал холдинга до нуля милливольта и отмените офсетный потенциал так, чтобы ток холдинга был нулевым пикоампером. Подойди к камере с записывающим пипеткой при применении положительного давления.
Когда пипетка находится в непосредственном контакте с клеточной мембраной, отпустите положительное давление и установите потенциал холдинга до минус 70 милливольт. Затем применить небольшое отрицательное давление, чтобы клеточная мембрана, чтобы прикрепить к стеклянной пипетки так, что gigaohm уплотнения формы. Компенсируют емкость пипетки и открывают клетку, применяя импульсы отрицательного давления.
Для исследования синаптической функции нанесите 0,1-миллисекундные импульсы тока через пипетку стимуляции. Мониторинг сопротивления серии непрерывно, применяя пятими милливольтный шаг. Сопротивление серии можно оценить, разделив пять милливольт на пик амплитуды вызываемого тока.
Используйте для анализа только клетки с сопротивлением серии меньше 20 мегаохм. Для маркировки биоцитина, поддерживать конфигурацию цельных клеток, по крайней мере пять минут, чтобы диффузии биоцитина в дистальных дендритов. После записи аккуратно удалите пипетки из клетки, чтобы сома не была уничтожена.
Подготовь тарелку культуры клетки 24-наилучшим образом. Заполните каждую колодец 300 микролитров 4%PFA. Позаботьтесь, чтобы не загрязнять ничего с PFA, которые будут в контакте с ломтиками, которые будут записаны.
Перенесите ломтики из камеры записи в пластину, содержащую PFA, с резиновым пипеткой и починьте их на ночь. На следующий день замените PFA на PBS. Держите ломтики в PBS на 4 градусах Celsius для будущей обработки.
Чтобы испачкать клетки, мыть ломтики со свежим PBS три раза. Блокируйте неспецифические связывающие участки, инкубируя ломтики в блокирующий раствор в течение двух часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Затем отбросьте блокирующий раствор и инкубировать ломтики стрептавидином Alexa 568, разбавленным блокирующим раствором при четырех градусах Цельсия на ночь на орбитальном шейкере.
На следующий день, отказаться от раствора антитела, и мыть ломтики три раза с PBS в течение 10 минут каждый при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Затем мыть ломтики с водопроводной водой перед монтажом. Поместите кусочки одной мыши на один стеклянный слайд.
Убедитесь, что окрашенные клетки присутствуют на верхней поверхности ломтиков. Усваивать воду вокруг ломтиков с тканями, а затем оставить ломтики высохнуть в течение примерно 15 минут. Впоследствии нанесите две капли монтажной среды на каждый кусочек и смонтировать крышку скольжения на слайде, не производя пузырьков воздуха.
Храните помеченные ломтики при четырех градусах по Цельсию после просмотра их с помощью конфокального микроскопа. Это ИК-DIC изображение показывает сома спинной боковой гениальный geniculate ядра реле нейрона с кончиком патч пипетки. Биоцитин окрашивание позволяет нам получить представление о зарегистрированных нейронов.
В отличается от интернейронов, которые имеют биполярную морфологию, реле нейроны имеют многополярные дендритические беседки, содержащие более трех первичных дендритов. Затем была проведена трехмерная реконструкция реле-нейрона с маркировкой биоцитина, которая показывает радиально симметричную дендритную архитектуру. Сохранение геничных входов сетчатки и корковых геникулятных входов в тех же срезах мозга являются наиболее важными в этом протоколе.
После этой процедуры, мы можем, например, также исследовать ингибитор входы из ядра reticularis талами на спинной боковой геникулярных нейронов ядра. Не забудьте надеть перчатки при фиксации ломтиков мозга с PFA, как PFA является опасным.
