مطلوب بروتوكول صارم جدا حتى نتمكن من مقارنة صحيحة الاستعدادات من نفس الحيوانات أو من الحيوانات المختلفة أو الشرايين في وجود أو عدم وجود الدهون التي تحيط بها أو في وجود أو عدم وجود endothelium. الميزة الرئيسية لهذه التقنية التجريبية هي أنه يمكننا مقارنة حلقات من نفس الشريان في ظل حالة متساوي القياس وبالتالي جعل استنتاجات صحيحة بشأن تأثير العوامل التجريبية التي نحقق فيها. يوفر هذا البروتوكول رؤى في تعديل استجابة الأوعية الدموية من قبل الأنسجة الدهنية الغدد الوعائية من الحيوانات المعدلة وراثيا مختلفة.
تمثل اختلالات الأنسجة الدهنية عامل خطر مستقل لارتفاع ضغط الدم ومضاعفاته القلبية الوعائية المرتبطة به. يتضمن myograph لدينا خطوات معقدة متعددة تتطلب الحذر الشديد في كل نقطة لتجنب إتلاف السفينة ، خاصة أثناء التركيب ، ولضمان استجابة السفينة بشكل مناسب لمختلف المحفزات. ابدأ هذا الإجراء مع الاستعدادات وتشريح الحلقات الشريانية المساريقية كما هو موضح في بروتوكول النص.
قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج تسجيل البيانات. حفظ التجربة كملف بيانات مخطط معملي باسم جديد لتجنب الكتابة فوق ملف الإعداد الأصلي. افتح إطار إعدادات التهيئة ثم قم بتعيين عامل K إلى واحد.
قبول القيم الافتراضية لمعايرة IPs وضغط الهدف ووقت متوسط عبر الإنترنت ووقت التأخير. انقر فوق "موافق" لحفظ الإعدادات. حدد القنوات ذات الاهتمام وإدخال قطر السلك، ونقاط النهاية للأنسجة، والقراءة الأولية للميكرومتر في نافذة التطبيع.
لبدء إجراءات التطبيع، وتطبيق أول تمتد السلبي على الأوعية الدموية عن طريق تحويل المسمار ميكرومتر عكس عقارب الساعة. بعد الانتظار ثلاث دقائق للسفينة لتحقيق الاستقرار، وإدخال القراءة ميكرومتر جديد في نافذة التطبيع. يتم حساب التوتر في الجدار تلقائياً، كما يظهر كنقطة في الرسم البياني.
بعد كل امتداد سلبي، استبدل حاجز كريبس التحكم بـ كريبس البوتاسيوم العالي iso-osmotic الذي يحتوي على كلوريد البوتاسيوم 150 ملليمولار. عندما يصل الانكماش إلى الهضبة في حوالي ثلاث دقائق ، سجل القوة النشطة عن طريق طرح القوة السلبية عند كل امتداد من قوة تنشيط البوتاسيوم. حساب التوتر الجدار، فضلا عن القيم محيط الداخلية.
إزالة حالة البوتاسيوم عالية عن طريق استبدال العازلة البوتاسيوم عالية مع عازلة كريبس الطازجة. كرر الغسيل ثلاث مرات على مدى خمس دقائق. كرر خطوات التطبيع عن طريق تحفيز تمتد السلبي تليها انكماش نشط في المنعطفات البديلة حتى يبدأ التوتر النشط في الانخفاض.
غسل جيدا من ارتفاع العازلة كريبس البوتاسيوم وتكريس الاستعدادات لآخر 30 إلى 45 دقيقة. إعادة ضبط التوترات القاعدية إلى الصفر بحيث سيتم تسجيل الاستجابات المتعاقدة النشطة فقط أثناء التجربة اللاحقة. إعداد وتركيب حلقات الشرايين المقترنة كما هو موضح في بروتوكول النص من الأجزاء المجاورة لكل شريان.
إعداد حلقة شريانية واحدة مع PVAT سليمة والأخرى مع إزالة PVAT. بعد التطبيع، precontract الأجزاء الشريانية مع ارتفاع البوتاسيوم كريبس العازلة بإضافة 115 ملليمتر كلوريد البوتاسيوم حل إلى غرفة تحتوي على كريبس. بعد الانكماش لفترة الهضبة، وغسل من البوتاسيوم عالية واستبدال العازلة مع عازلة كريبس الهواء النقي.
كرر الغسيل ثلاث مرات على مدى خمس دقائق. كرر تحفيز كلوريد البوتاسيوم وغسل ثلاث مرات وسجل أقصى استجابة انكماشية لكلوريد البوتاسيوم عن طريق طرح التوتر الأساسي من التوتر بسبب تحفيز كلوريد البوتاسيوم. بعد الانكماش الأخير والغسيل، إعادة ملء الغرفة مع الحارة، ومخزنة يهبس، والسماح للشريان لاسترداد لحوالي 30 دقيقة قبل تنفيذ المهمة التالية.
إلى كل غرفة، إضافة الكميات التراكمية من الفينيلفرين للحث على الزيادات التي تعتمد على التركيز والتوتر متساوي القياس من الاستعدادات هادئة. بعد إضافة الجرعة الأخيرة من ناهض، وغسل المخدرات جيدا وإعادة ملء الغرفة مع عازلة كريبس الطازجة. رسم الردود تعتمد التركيز كما زيادة النسب المئوية من كلوريد البوتاسيوم الناجمة عن تقلصات الحد الأقصى.
لتقييم مساهمة أكسيد النيتريك، احتضان الاستعدادات مع مثبط أكسيد النيتريك سينثاز L-NAME لمدة 30 دقيقة قبل إضافة فينيليفرين. لأداء منحنى استجابة تركيز الثاني بالتسلسل، وغسل الغرفة تماما ومرّاً وتكراراً لإزالة كل من الناهضين السابقة حتى لا يتم ملاحظة أي تغييرات أخرى في لهجة. تم تطبيع العلاقة بين الطول والتوتر للشرايين المساريق معزولة عن نماذج الماوس التي تغذيها بـ chow القياسي أو نظام غذائي عالي الدهون.
وقد تم تأسيس علاقة سلبية بين الطول والتوتر عن طريق التمدد التدريجي للأجزاء من الشريان إلى أن تم الحصول على محيط داخلي يعادل 100 ملليمتر من الضغط العابر للزئبق، أو IC100. بعد كل امتداد، تم تطبيق كلوريد البوتاسيوم 115 ملليمولر لتحفيز الانقباضات. تم رسم منحنيات التوتر النشطة من بيانات القوة النشطة على المحور ص وقيم IC المحسوبة من بيانات ميكرومتر على المحور س.
قيمة IC تقع داخل هضبة الذروة IC1. وحُسب عامل التطبيع K كنسبة من IC1 وIC100، والتي يمكن بعد ذلك تطبيقها على عينات من نفس نوع السفينة في التجربة اللاحقة. يظهر هنا هي تسجيلات الإخراج من استجابات فاسوكونسرتريكور فينيليفرين في الشرايين المساريقية مع أو بدون PVAT المحيطة.
تم تطبيق التركيزات التراكمية من الفينيلفرين لتحفيز تقلصات الشرايين المسنتة التي تم جمعها من adiposet 16 أسبوعا اديبوست واحد الفئران. وقد سُجلت الردود على التقلصات واحتسبت كنسبة مئوية من 150 ملليمولار من انكماش البوتاسيوم المستحث بأقصى حد. تم رسم المنطقة تحت منحنيات الانقباض للمقارنة.
لاحظ أن PVAT من adiposet واحد الفئران أثار تأثير مضاد للانقباض على الاستجابة إلى فينيليفرين. عند الحصول على تقلصات من قبل KCL الناجمة عن, الاستجابات يجب أن تكون مستقرة وثابتة. إذا كانت الاستجابة لا تزال في ازدياد بعد ثلاث إدارات تدريجية من KCL، قد تكون هناك حاجة إلى تحفيز KCL.
لتحقيق الظروف المثلى للتوترات ، فإن خطوة التطبيع مهمة للغاية ، حيث أن هذا يحدد قوة فتح الأوعية الدموية. إذا لم يتم ذلك بشكل صحيح ، فإنه سيؤثر على التجربة بأكملها. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على إعدادات أخرى بالإضافة إلى انكماش أو استرخاء مستحث فينيليفرين.
على سبيل المثال، في وجود أو عدم وجود الأنسجة الدهنية perivascular، والأعصاب اللاإرادية، أو endothelium. مع هذا البروتوكول، يمكن للباحثين فحص الأوعية الدموية الصغيرة من نماذج الحيوانات المريضة في ظل ظروف مختلفة فيزيائية مرضية، مثل السمنة والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية.
