Çok sıkı bir protokol biz geçerli olarak aynı hayvanların veya farklı hayvanlar veya arterlerden onları çevreleyen yağ varlığı veya yokluğunda veya endotel varlığı veya yokluğunda preparatları karşılaştırabilirsiniz gereklidir. Bu deneysel tekniğin en büyük avantajı, izometrik koşullar altında aynı arter halkalarını karşılaştırabiliyor ve böylece araştırdığımız deneysel faktörlerin etkisi hakkında geçerli sonuçlara varabiliyoruz. Bu protokol, genetik olarak değiştirilmiş farklı hayvanların perivasküler yağ dokuları tarafından vasküler duyarlılık modülasyonu içine anlayışlar sağlar.
Yağ dokusu bozuklukları hipertansiyon ve ilişkili kardiyovasküler komplikasyonlar için bağımsız bir risk faktörü temsil eder. Miyografımız, özellikle montaj sırasında damara zarar vermemek ve geminin çeşitli uyaranlara uygun şekilde yanıt vermesini sağlamak için her noktada aşırı dikkatli olunması gereken çok sayıda karmaşık adım içerir. Metin protokolünde açıklandığı gibi mezenterik arter halkalarının preparatları ve diseksiyonu ile bu prosedüre başlayın.
Bilgisayarı açın ve veri kayıt yazılımını açın. Denemeyi, özgün ayar dosyasının üzerine yazmamak için yeni bir ada sahip bir laboratuvar grafiği veri dosyası olarak kaydedin. Normalleştirme ayarları penceresini açın ve K faktörlü bir ekive ayarlayın.
IP kalibrasyonu, hedef basıncı, çevrimiçi ortalama süre ve gecikme süresi için varsayılan değerleri kabul edin. Ayarları kaydetmek için tamam'ı tıklatın. İlgi alan kanalları seçin ve normalleştirme penceresinde tel çapını, doku uç noktalarını ve ilk mikrometre okumasını girdi.
Normalleştirme işlemini başlatmak için, mikrometre vidasını saat yönünün tersine çevirerek kan damarına ilk pasif esneme uygulayın. Geminin stabilize olması için üç dakika bekledikten sonra, normalleştirme penceresine yeni mikrometre okumasını girdi. Duvar gerilimi otomatik olarak hesaplanır ve grafikte bir nokta olarak gösterilir.
Her pasif streç sonra, 150 milimolar potasyum klorür içeren bir izo-ozmotik yüksek potasyum krebs ile kontrol krebs tampon değiştirin. Kasılma yaklaşık üç dakika bir plato ulaştığında, potasyum aktive kuvvet her streç pasif kuvvet çıkararak aktif kuvvet kaydedin. Duvar gerilimini ve iç çevre değerlerini hesaplayın.
Taze krebs tampon ile yüksek potasyum tampon değiştirerek yüksek potasyum durumu kaldırın. Beş dakika boyunca üç kez yıkama tekrarlayın. Aktif gerilim azalmaya başlayana kadar alternatif dönüşlerde aktif daralma nın ardından pasif esnemeler başlatarak normalleştirme adımlarını tekrarlayın.
Iyice yüksek potasyum krebs tampon yıkayın ve başka bir 30 ila 45 dakika için hazırlıkları dengeleyin. Sonraki deneme sırasında yalnızca etkin kontraktil yanıtlar kaydedilebilsin diye bazal gerilimleri sıfırla. Her arterin bitişik bölümlerinden metin protokolünde açıklandığı gibi eşleştirilmiş arter halkalarını hazırlayın ve monte edin.
PVAT bozulmamış bir arter halkası hazırlayın ve PVAT kaldırıldı ile diğer. Normalizasyondan sonra, krebs içeren odaya 115 milimolar potasyum klorür çözeltisi ekleyerek yüksek potasyum krebs tampon ile arteriyel segmentleri ön sözleşme. Plato dönemine daralma sonrasında, yüksek potasyum yıkama ve taze aerated krebs tampon ile tampon değiştirin.
Beş dakika boyunca üç kez yıkama tekrarlayın. Potasyum klorür stimülasyonu ve yıkama üç kez tekrarlayın ve potasyum klorür stimülasyonu nedeniyle gerginlik taban gerilimi çıkararak potasyum klorür için maksimal kontraktil yanıt kaydedin. Son kasılma ve yıkama sonra, sıcak, havalandırılmış krebs tampon ile oda doldurmak ve arter sonraki görevi gerçekleştirmeden önce yaklaşık 30 dakika kurtarmak için izin.
Her odaya, konsantrasyona bağlı artışları ve quiescent preparatların izometrik gerilimini tetiklemek için kümülatif miktarda fenilefrin ekleyin. Agonist son dozu ekledikten sonra, iyice ilaç yıkayın ve taze krebs tampon ile oda doldurmak. Potasyum klorür maksimal kasılmalar indüklenen artan yüzdeleri olarak konsantrasyon bağımlı yanıtları arsa.
Nitrik oksit katkısını değerlendirmek için, fenilefrin eklenmesinden önce 30 dakika boyunca nitrik oksit syntaz inhibitörü L-NAME ile preparatları kuluçkaya yatırın. İkinci bir konsantrasyon yanıt eğrisini sırayla gerçekleştirmek için, tonda başka bir değişiklik görülmeyene kadar önceki agonistlerin tümlerini çıkarmak için odayı tamamen ve tekrar tekrar yıkayın. Standart yemek veya yüksek yağlı diyet ile beslenen fare modellerinden izole edilen mezenterik arterler için uzunluk-gerilim ilişkisinin normalizasyonu yapıldı.
100 milimetreci cıva transmural basıncına veya IC100'e karşılık gelen iç çevre elde edilene kadar arter segmentlerinin kademeli olarak gerilerek pasif bir uzunluk-gerilim ilişkisi kuruldu. Her esnemeden sonra, 115 milimolar potasyum klorür kasılmaları uyarmak için uygulandı. Aktif uzunluk gerilim eğrileri Y eksenindeki aktif kuvvet verilerinden ve X eksenindeki mikrometre verilerinden hesaplanan IC değerlerinden çizilmiştir.
Tepe platosu içinde bulunan bir IC değeri IC1'dir. Normalleştirme faktörü K, ic1 ve IC100 oranı olarak hesaplandı ve bu oran sonraki deneyde aynı damar tipi örneklere uygulanabiliyordu. Burada gösterilen mesenterik arterlerde fenilefrin vazokonstriktör yanıtlarının çıkış kayıtları veya çevreleyen PVAT olmadan.
Fenilefrin kümülatif konsantrasyonları 16 haftalık adiposet bir fare toplanan mezenterik arterlerin kasılmaları uyarmak için uygulandı. Kontraktil tepkiler 150 milimolar potasyum klorür sonucu maksimal kontraksiyon yüzdesi olarak kaydedildi ve hesaplandı. Daralma eğrilerinin altındaki alan karşılaştırma için çizilmiştir.
Adiposet bir fareden PVAT fenilefrin yanıtı üzerinde bir anti-kontraktil etkisi ortaya olduğunu unutmayın. KCL kaynaklı kasılmalar elde ederken, yanıtlar istikrarlı ve sabit olmalıdır. KCL'nin üç artımlı uygulamasından sonra yanıt hala artıyorsa, KCL stimülasyonu gerekebilir.
Gerginliklerin en uygun koşullarını elde etmek için, normalleşme adımı çok önemlidir, bu kan damarlarını açmak için kuvvet belirler gibi. Eğer düzgün yapılmazsa, tüm deneyi etkileyecek. Bu protokol fenilefrin kaynaklı kasılma veya gevşemeye ek olarak diğer ayarlara da uygulanabilir.
Örneğin, perivasküler yağ dokusu, otonom sinirler veya endotel varlığı veya yokluğunda. Bu protokol ile araştırmacılar, hastalıklı hayvan modellerinden küçük kan damarlarını obezite, diyabet ve kardiyovasküler hastalıklar gibi farklı patofizyolojik koşullar altında inceleyebilirler.
