Un protocole très strict est nécessaire afin que nous puissions valablement comparer les préparations des mêmes animaux ou de différents animaux ou artères en présence ou en l’absence de la graisse qui les entoure ou en présence ou en l’absence de l’endothélium. Le principal avantage de cette technique expérimentale est que nous pouvons comparer les anneaux d’une même artère dans un état isométrique et donc valablement tirer des conclusions concernant l’impact des facteurs expérimentaux que nous étudions. Ce protocole donne un aperçu de la modulation de la réactivité vasculaire par les tissus adipeux périvasculaires de différents animaux génétiquement modifiés.
Les dysfonctionnements adipeux de tissu représentent un facteur de risque indépendant pour l’hypertension et ses complications cardio-vasculaires associées. Notre myographe comporte de multiples étapes compliquées qui exigent une extrême prudence à chaque point pour éviter d’endommager le navire, en particulier pendant le montage, et pour s’assurer que le navire réagit de façon appropriée à divers stimuli. Commencez cette procédure par des préparations et une dissection des anneaux artériaux mésentériques tels que décrits dans le protocole de texte.
Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel d’enregistrement de données. Enregistrez l’expérience en tant que fichier de données de graphique de laboratoire avec un nouveau nom pour éviter de surécrire le fichier de paramètre d’origine. Ouvrez la fenêtre paramètres de normalisation et réglez le facteur K en un seul.
Acceptez les valeurs par défaut pour l’étalonnage des ADRESSES, la pression cible, le temps de moyenne en ligne et le temps de retard. Cliquez bien pour enregistrer les paramètres. Sélectionnez les canaux d’intérêt et entrez le diamètre du fil, les paramètres des tissus et la lecture initiale du micromètre dans la fenêtre de normalisation.
Pour commencer la procédure de normalisation, appliquez le premier étirement passif sur le vaisseau sanguin en tournant la vis du micromètre dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Après avoir attendu trois minutes que le navire se stabilise, entrez la nouvelle lecture du micromètre dans la fenêtre de normalisation. La tension du mur est automatiquement calculée et affichée comme un point sur le graphique.
Après chaque étirement passif, remplacer le tampon krebs de contrôle par un krebs iso-osmotique à haute teneur en potassium contenant du chlorure de potassium de 150 millimlaires. Lorsque la contraction atteint un plateau à environ trois minutes, enregistrer la force active en soustrayant la force passive à chaque étirement de la force activée par le potassium. Calculez la tension du mur, ainsi que les valeurs de circonférence interne.
Enlevez l’état élevé de potassium en remplaçant le tampon de potassium élevé par le tampon frais de krebs. Répéter le lavage trois fois sur cinq minutes. Répétez les étapes de normalisation en induisant des étirements passifs suivis d’une contraction active dans d’autres virages jusqu’à ce que la tension active commence à diminuer.
Bien laver le tampon krebs à haute teneur en potassium et équilibrer les préparations pendant encore 30 à 45 minutes. Réinitialiser les tensions basales à zéro de sorte que seules les réponses contractiles actives seront enregistrées au cours de l’expérience suivante. Préparer et monter des anneaux artériels appariés tels que décrits dans le protocole de texte des sections adjacentes de chaque artère.
Préparer un anneau artélial avec PVAT intact et l’autre avec PVAT enlevé. Après normalisation, précontractez les segments artériaux avec le tampon élevé de krebs de potassium en ajoutant la solution de chlorure de potassium de 115 millimlaires à la chambre contenant des krebs. Après contraction à la période du plateau, laver le potassium élevé et remplacer le tampon par tampon krebs aéré frais.
Répéter le lavage trois fois sur cinq minutes. Répétez la stimulation du chlorure de potassium et le lavage trois fois et enregistrez la réponse contractile maximale au chlorure de potassium en soustrayant la tension de base de la tension due à la stimulation du chlorure de potassium. Après la dernière contraction et le lavage, remplissez la chambre d’un tampon krebs chaud et aéré et laissez l’artère récupérer pendant environ 30 minutes avant d’effectuer la tâche suivante.
À chaque chambre, ajouter des quantités cumulatives de phényléphrine pour induire les augmentations dépendantes de la concentration et la tension isométrique des préparations quiescentes. Après avoir ajouté la dernière dose d’agoniste, lavez soigneusement le médicament et remplissez la chambre avec un tampon krebs frais. Tracez les réponses dépendantes de la concentration comme des pourcentages croissants de contractions maximales induites par le chlorure de potassium.
Pour évaluer la contribution de l’oxyde nitrique, incuber les préparations avec l’inhibiteur de synthase d’oxyde nitrique L-NAME pendant 30 minutes avant l’ajout de phényléphrine. Pour effectuer une deuxième courbe de réponse de concentration séquentiellement, lavez la chambre complètement et à plusieurs reprises pour enlever tous les agonistes précédents jusqu’à ce qu’aucun autre changement de ton ne soit observé. La normalisation de la relation longueur-tension a été effectuée pour les artères mesenteric isolées des modèles de souris alimentés avec le chow standard ou un régime à haute teneur en graisses.
Une relation longueur-tension passive a été établie par étirement progressif des segments d’artère jusqu’à ce qu’une circonférence interne correspondant à 100 millimètres de pression trans-muros de mercure, ou IC100, ait été obtenue. Après chaque étirement, 115 millimolaire chlorure de potassium a été appliqué pour stimuler les contractions. Les courbes de tension de longueur active ont été tracées à partir des données de force active sur l’axe Y et des valeurs IC calculées à partir des données micromètres de l’axe X.
Une valeur IC se trouvant dans le plateau de pointe est IC1. Le facteur de normalisation, K, a été calculé comme le rapport d’IC1 et d’IC100, qui pourrait ensuite être appliqué à des échantillons du même type de navire dans l’expérience subséquente. On y voit des enregistrements de sortie des réponses vasoconstrictrices à la phényléphrine dans les artères mésentériques avec ou sans PVAT environnant.
Des concentrations cumulatives de phényléphrine ont été appliquées pour stimuler les contractions des artères mésentériques recueillies chez une souris adiposet vieille de 16 semaines. Les réponses contractiles ont été enregistrées et calculées en pourcentage de la contraction maximale induite par le chlorure de potassium de 150 millimlaires. La zone sous les courbes de contraction ont été tracées à des fins de comparaison.
Notez que PVAT de l’adiposet une souris a obtenu un effet anti-contractile sur la réponse à la phényléphrine. Lors de l’obtention de contractions induites par KCL, les réponses doivent être stables et stables. Si la réponse augmente encore après trois administrations incrémentielles de KCL, la stimulation de KCL peut être nécessaire.
Pour atteindre des conditions optimales des tensions, l’étape de normalisation est très importante, car cela détermine la force d’ouvrir les vaisseaux sanguins. Si ce n’est pas fait correctement, cela affectera l’ensemble de l’expérience. Ce protocole peut être appliqué à d’autres paramètres en plus de la contraction ou de la relaxation induite par la phényléphrine.
Par exemple, en présence ou en l’absence de tissu adipeux périvasculaire, de nerfs autonomes ou d’endothélium. Avec ce protocole, les chercheurs peuvent examiner les petits vaisseaux sanguins à partir de modèles animaux atteints de maladies dans différentes conditions pathophysiologiques, telles que l’obésité, le diabète et les maladies cardiovasculaires.
