Se requiere un protocolo muy estricto para que podamos comparar válidamente preparaciones de los mismos animales o de diferentes animales o arterias en presencia o ausencia de la grasa que los rodea o en presencia o ausencia del endotelio. La principal ventaja de esta técnica experimental es que podemos comparar anillos de la misma arteria bajo condición isométrica y así sacar conclusiones válidas sobre el impacto de los factores experimentales que investigamos. Este protocolo proporciona información sobre la modulación de la capacidad de respuesta vascular por tejidos adiposos perivasculares de diferentes animales modificados genéticamente.
Las disfunciones del tejido adiposo representan un factor de riesgo independiente para la hipertensión y sus complicaciones cardiovasculares asociadas. Nuestro miógrafo implica múltiples pasos complicados que requieren extrema precaución en cada punto para evitar dañar el recipiente, especialmente durante el montaje, y para asegurarse de que el recipiente responde adecuadamente a varios estímulos. Comience este procedimiento con preparaciones y disección de los anillos arteriales mesentéricos como se describe en el protocolo de texto.
Encienda el ordenador y abra el software de grabación de datos. Guarde el experimento como un archivo de datos de gráfico de laboratorio con un nuevo nombre para evitar sobrescribir el archivo de configuración original. Abra la ventana de configuración de normalización y establezca el factor K en uno.
Acepte los valores predeterminados para la calibración de direcciones IP, la presión objetivo, el tiempo de promediación en línea y el tiempo de retardo. Haga clic en Aceptar para guardar la configuración. Seleccione los canales de interés e introduzca el diámetro del cable, los puntos finales del tejido y la lectura inicial del micrómetro en la ventana de normalización.
Para iniciar el procedimiento de normalización, aplique el primer estiramiento pasivo al vaso sanguíneo girando el tornillo micrómetro en sentido antihorario. Después de esperar tres minutos para que el recipiente se estabilice, introduzca la nueva lectura del micrómetro en la ventana de normalización. La tensión de la pared se calcula automáticamente y se muestra como un punto en el gráfico.
Después de cada estiramiento pasivo, reemplace el tampón de krebs de control por un krebs iso-osmóticos altos en potasio que contengan cloruro de potasio de 150 mililitrolares. Cuando la contracción alcance una meseta en unos tres minutos, registre la fuerza activa restando la fuerza pasiva en cada tramo de la fuerza activada por potasio. Calcular la tensión de la pared, así como los valores de circunferencia interna.
Elimine la condición alta de potasio reemplazando el tampón de potasio alto con un tampón de krebs fresco. Repita el lavado tres veces durante cinco minutos. Repita los pasos de normalización induciendo estiramientos pasivos seguidos de contracción activa en giros alternativos hasta que la tensión activa comience a disminuir.
Lave a fondo el tampón de krebs de potasio alto y equilibre las preparaciones durante otros 30 a 45 minutos. Restablezca las tensiones basales a cero para que solo se registren las respuestas contráctiles activas durante el experimento posterior. Preparar y montar anillos arteriales emparejados como se describe en el protocolo de texto de las secciones adyacentes de cada arteria.
Prepare un anillo arterial con PVAT intacto y el otro con PVAT eliminado. Después de la normalización, precontrate los segmentos arteriales con alto tampón de krebs de potasio añadiendo 115 solución de cloruro de potasio milimolar a la cámara que contiene krebs. Después de la contracción al período de la meseta, lave el potasio alto y reemplace el tampón con un tampón de krebs aireados frescos.
Repita el lavado tres veces durante cinco minutos. Repita la estimulación del cloruro de potasio y el lavado tres veces y registre la respuesta máxima contráctil al cloruro de potasio restando la tensión basal de la tensión debida a la estimulación del cloruro de potasio. Después de la última contracción y lavado, rellene la cámara con un tampón de krebs caliente y aireado y permita que la arteria se recupere durante unos 30 minutos antes de realizar la siguiente tarea.
A cada cámara, añadir cantidades acumuladas de fenilefrina para inducir los aumentos dependientes de la concentración y la tensión isométrica de los preparados de reposo. Después de añadir la última dosis de agonista, lavar el medicamento a fondo y rellenar la cámara con tampón de krebs frescos. Trazar las respuestas dependientes de la concentración como porcentajes crecientes de las contracciones máximas inducidas por cloruro de potasio.
Para evaluar la contribución del óxido nítrico, incubar los preparados con el inhibidor de la síntesis de óxido nítrico L-NAME durante 30 minutos antes de la adición de fenilefrina. Para realizar una segunda curva de respuesta de concentración secuencialmente, lave la cámara completa y repetidamente para eliminar todos los agonistas anteriores hasta que no se observen más cambios de tono. Se realizó la normalización de la relación longitud-tensión para las arterias mesentéricas aisladas de modelos de ratón alimentados con comida estándar o una dieta alta en grasas.
Se estableció una relación longitud-tensión pasiva mediante el estiramiento incremental de los segmentos de la arteria hasta que se obtuvo una circunferencia interna correspondiente a 100 milímetros de presión transmural de mercurio, o IC100. Después de cada estiramiento, se aplicó cloruro de potasio militimario de 115 mililitros para estimular las contracciones. Las curvas de tensión de longitud activa se trazaron a partir de los datos de fuerza activa en el eje Y y los valores IC calculados a partir de los datos del micrómetro en el eje X.
Un valor IC que se encuentra dentro de la meseta del pico es IC1. El factor de normalización, K, se calculó como la relación de IC1 e IC100, que luego podría aplicarse a muestras del mismo tipo de recipiente en el experimento posterior. Aquí se muestran grabaciones de salida de las respuestas vasoconstrictoras a fenilefrina en arterias mesentéricas con o sin PVAT circundante.
Se aplicaron concentraciones acumuladas de fenilefrina para estimular las contracciones de las arterias mesentéricas recogidas de 16 semanas de edad adiposet un ratones. Las respuestas contráctiles se registraron y calcularon como un porcentaje de 150 contracción máxima inducida por cloruro de potasio milimétrico. El área bajo las curvas de contracción se trazaron para la comparación.
Tenga en cuenta que PVAT de adiposet un ratone provocó un efecto anticontráctil en la respuesta a la fenilefrina. Al obtener contracciones inducidas por KCL, las respuestas tienen que ser estables y estables. Si la respuesta sigue aumentando después de tres administraciones incrementales de KCL, puede ser necesaria la estimulación de KCL.
Para lograr condiciones óptimas de las tensiones, el paso de normalización es muy importante, ya que esto determina la fuerza para abrir los vasos sanguíneos. Si no se hace correctamente, afectará a todo el experimento. Este protocolo se puede aplicar a otros entornos además de la contracción o relajación inducida por fenilefrina.
Por ejemplo, en presencia o ausencia de tejido adiposo perivascular, nervios autónomos o endotelio. Con este protocolo, los investigadores pueden examinar pequeños vasos sanguíneos a partir de modelos animales enfermos bajo diferentes condiciones fisiopatológicas, como obesidad, diabetes y enfermedades cardiovasculares.
