البحث البروتين البروتين البروتين التفاعل لا غنى عنه لفهم العمليات الفسيولوجية في العديد من المجالات. في هذا الفيديو نقدم تقنية الهضم على الغشاء الذي يسمح للباحثين لإجراء تحليل شامل للبروتينات ملزمة من قبل مرض التصلب العصبي المتعدد بطريقة مريحة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تحسين إنتاجية التحليل البروتيني للمناعة الخام لأن فصل البروتينات بواسطة الجل البولي أكريلاميد الكهربائي ليس ضروريًا.
تبدأ الاقتران الجسم المضاد إلى الخرز المغناطيسي، عن طريق خلط الأجسام المضادة لـ GFP مع الخرز في 500 ميكرولترات من الفوسفات العازلة سيترات. تدوير الخليط في 50 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الخرز المقترن ثلاث مرات مع العازلة الفوسفات سيترات تحتوي على 1٪ polysorbate 20.
الخلايا المصابة بالLyse وفقا لاتجاهات المخطوطات. كشط الطبق ونقل lysate في أنبوب اختبار 1.5 ملليلتر. ثم مسح lysate عن طريق الطرد المركزي في 15، 000 x ز لمدة خمس دقائق وجمع supernatant.
إعداد الخرز المغناطيسي غير المُوَمَّن بغسلها ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من عازل الفوسفات سيترات. بعد الغسيل النهائي، إزالة العازلة وإضافة الخلية lysate إلى الخرز. تدوير الخليط في 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
أداء فصل المغناطيسي على موقف مغناطيسي وجمع الخلية lysate. لربط البروتينات المستهدفة إلى الخرز المترافقة مع الغلوبولين المناعي ، ضع الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة خمس دقائق. تجاهل المخزن المؤقت citrate وإضافة الخلية lysate إلى الخرز.
تدوير الخليط لمدة ساعة واحدة في 50 دورة في الدقيقة. لفصل البروتينات المستهدفة من البروتينات غير المستهدفة المجانية ، اغسل الخرز ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من عازل الفوسفات سيترات التي تحتوي على 1 ٪ من البوليسوربات 20. بعد الغسيل النهائي، إضافة 30 ميكرولترات من العازلة سيترات، والسماح للخرز الجلوس لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ل elute البروتينات المستهدفة.
لتحضير الغشاء، قم بقطع أغشية PVDF إلى 3 ملليمترات من خلال قطع 3 ملليمترات باستخدام مقص جراحي تم تنظيفه قبل الاستخدام مباشرة. ضع قطعة من الغشاء على رقائق الألومنيوم وإضافة اثنين إلى خمسة ميكرولترات من الإيثانول إلى كل قطعة. قبل الأغشية جافة تماما، إضافة اثنين إلى خمسة ميكرولترات من بروتين الوميضة إلى كل قطعة والهواء الجافة حتى يصبح سطح الغشاء غير لامع.
ثم نقل الأغشية إلى 1.5 ملليلتر أنابيب وتخزينها في أربع درجات مئوية. إذا كان استخدام على الفور، إضافة اثنين إلى 30 ميكرولترات من الإيثانول الذي سيجعلهم هيدروفيلي. إزالة الإيثانول مع ماصة، ولكن قبل أن تجف الأغشية، إضافة تماما 200 ميكرولترات من حل رد فعل DTT القائم على كل أنبوب، واحتضان لهم في 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد الحضانة، استبدال حل رد فعل مع 300 ميكرولترات من محلول iodoacetamide، واحتضان في الظلام لمدة 45 دقيقة. ثم غسل الأغشية مرتين مع الماء المقطر ومرة واحدة مع 2٪ الأسيتونيتريل من قبل دوامة لمدة عشر ثوان على الأقل. يمكن أن يكون العمل مع الأسيتونيتريل ذات الصلة بغشاء الغشاء الصلزي خطرًا للغاية.
وينبغي دائما ارتداء قناع, نظارات وقفازات عند إجراء عملية الهضم على الغشاء. إعداد التربسين وفقا لاتجاهات المخطوطات، وإضافة 100 ميكرولترات من محلول رد فعل التربسين لكل غشاء. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للهضم.
في اليوم التالي، نقل حل رد فعل إلى أنبوب 1.5 ملليلتر نظيفة، وإضافة 100 ميكرولترات من حلول الغسيل للغشاء. احتضان الغشاء في 60 درجة مئوية لمدة ساعتين، ثم جمع محلول الغسيل ومزجها مع حل رد فعل. إضافة آخر 100 ميكرولترات من محلول الغسيل إلى الغشاء و sonicate لمدة 10 دقائق.
ثم جمع محلول الغسيل ومزجها مع حل رد الفعل. غطي أنبوب الاختبار بقطعة من الأفلام المختبرية واصنع ثقوب صغيرة في الفيلم بإبرة. جفف المحلّل باستخدام مُركز فراغي، واحلّ البقايا في 10 ميكرولترات من حمض فورميك 2٪.
الطرد المركزي الأنبوب في 12، 000 س ز لمدة ثلاث دقائق، ونقل المابير في أنبوب عينة. تحليل العينة باستخدام مطياف كتلة مرتبطة نظام نانو LC / HPLC. وباستخدام هذا البروتوكول، تم تحديد 17 بروتينًا في المُعَد المناعي المرتبط بـ Calpain-6، و15 بروتينًا في المُعَدّة المناعية المرتبطة بـ GFP، و11 بروتينًا تم تحديدها في كلا الحالتين.
من المهم ملاحظة أن الكشف عن جزء ببتيد عالي الدقة مطلوب لتحديد البروتين المرشح بشكل إيجابي. تم حذف البروتينات التي عجلت في lysate التعبير عن GFP وكذلك histones ، والبروتينات الخارجية والريبوسية من القائمة. غسل الأغشية قبل الهضم التريبتيك مع الماء المقطر و 2٪ الأسيتونتريل هو أهم خطوة في إجراء الهضم على الغشاء على البروتينات.
باتباع هذه الطريقة، من الممكن التأكد من التهطال المشترك للبروتين المستهدف بإجراء تجارب أخرى، مثل التحلل المناعي وتحليل البقعة الغربية. هذه الطريقة البسيطة تسمح للباحثين باستكشاف التفاعلات الجديدة بين البروتين والبروتين مع تحليل مناسب وعالي الحساسية.
