タンパク質とタンパク質の相互作用を研究することは、いくつかの分野で生理的プロセスを理解するために不可欠です。本ビデオでは、MSによる結合タンパク質の包括的な解析を簡便に行える膜消化技術を紹介します。この技術の主な利点は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質の分離が必要ないため、粗免疫沈降物のプロテオミクス解析のスループットを向上できることです。
500マイクロリットルのクエン酸リン酸緩衝液中のビーズと抗GFP抗体を混合することによって、抗体を磁気ビーズに結合し始める。混合物を室温で1時間50 RPMで回転させます。次いで、1%ポリソルベート20を含むクエン酸塩リン酸緩衝液で共役ビーズを3回洗浄する。
原稿の方向に従って細胞をトランスフェクトする。皿を削り、1.5ミリリットルの試験管にライセートを移します。その後、15,000 x gで5分間遠心分離して糖を取り除き、上清を回収します。
500マイクロリットルのクエン酸リン酸バッファーで3回洗浄して、ラベルなしの磁気ビーズを調製します。最後の洗浄後、バッファーを取り出し、ビーズに細胞のライセートを加えます。混合物を室温で30分間50RPMで回転させます。
磁気スタンドで磁気分離を行い、細胞のライセートを収集します。標的タンパク質を免疫グロブリン結合ビーズに結合するには、ビーズを磁気スタンドに5分間置きます。クエン酸バッファーを廃棄し、ビーズに細胞ライセートを追加します。
混合物を50RPMで1時間回転させます。遊離非標的タンパク質から標的タンパク質を分離するには、ビーズを1%ポリソルベート20を含むクエン酸リン酸緩衝液500マイクロリットルで3回洗浄する。最後の洗浄の後、30マイクロリットルのクエン酸バッファーを加え、ビーズを室温で5分間座らせて標的タンパク質を溶出させます。
膜を準備するために、使用直前に洗浄した外科用はさみを使用して、PVDF膜を3ミリメートルで3ミリメートルに切り取ります。膜片をアルミ箔に置き、各部分に2~5マイクロリットルのエタノールを加えます。膜が完全に乾燥する前に、各部分に溶出したタンパク質の2〜5マイクロリットルを加え、膜表面がマットになるまで空気乾燥します。
その後、1.5ミリリットルのチューブに膜を転送し、摂氏4度でそれらを保存します。すぐに使用する場合は、2〜30マイクロリットルのエタノールを加え、親水性になります。ピペットでエタノールを取り除くが、膜が乾燥する前に、各チューブに200マイクロリットルのDTTベースの反応溶液を完全に加え、摂氏56度で1時間インキュベートする。
インキュベーション後、反応液を300マイクロリットルのヨウドアセトアミド溶液に交換し、暗闇中で45分間インキュベートする。その後、膜を蒸留水で2回洗浄し、少なくとも10秒間ボルテックスで2%アセトニトリルで1回洗浄します。ディアファナス関連アセトニトリルの操作は非常に危険なことができます。
膜消化手順を実行する際には、マスク、眼鏡、手袋を着用してください。原稿の指示に従ってトリプシンを準備し、各膜にトリプシン反応液の100マイクロリットルを追加します。消化のために摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、反応液をクリーンな1.5ミリリットルチューブに移し、100マイクロリットルの洗浄液を膜に加えます。膜を摂氏60度で2時間インキュベートし、洗浄液を回収し、反応溶液と混合します。膜に別の100マイクロリットルの洗浄液を加え、10分間超音波処理します。
次に、洗浄液を回収し、反応液と混合します。試験管を実験室のフィルムで覆い、針でフィルムに小さな穴を作ります。真空濃縮器を用いて溶液を乾燥させ、2%のギ酸の10マイクロリットルに残渣を溶解する。
チューブを12,000xgで3分間遠心し、上清をサンプルチューブに移します。ナノLC/HPLCシステムに連結した質量分析計を用いてサンプルを分析します。このプロトコルを用いて、カルパイン-6関連免疫沈降剤で17個のタンパク質を同定し、GFP関連免疫沈降剤で15個、および11個のタンパク質を両方で同定した。
候補タンパク質の正の同定には、少なくとも1つの高忠実度ペプチド断片の検出が必要であることに注意することが重要です。GFP発現リセートで沈殿したタンパク質、ヒストン、外生およびリボソームタンパク質はリストから除外された。蒸留水と2%アセトニトリルでトリプスト消化前に膜を洗浄することは、タンパク質に対する膜消化の手順において最も重要なステップです。
この方法に従って、免疫沈降法やウェスタンブロット解析などの他の実験を行うことで標的タンパク質の共沈殿を確認することができる。この簡単な方法により、研究者は便利で高感度な分析で新しいタンパク質とタンパク質の相互作用を探求することができます。
