Pesquisar a interação proteína-proteína é indispensável para a compreensão de processos fisiológicos em diversos campos. Neste vídeo introduzimos a técnica de digestão na membrana que permite aos pesquisadores realizar uma análise abrangente das proteínas de ligação por MS de forma conveniente. A principal vantagem desta técnica é que podemos melhorar o throughput de análise proteômica para imunoprecipitantes brutos porque a separação de proteínas por eletroforese de gel de poliacrilamida não é necessária.
Comece a conjugar o anticorpo às contas magnéticas, misturando o anticorpo anti-GFP com as contas em 500 microliters de tampão fosfato citrato. Gire a mistura a 50 RPM por uma hora em temperatura ambiente. E depois lave as contas conjugadas três vezes com tampão fosfato citrato contendo 1% de polisorbato 20.
Células transfectadas de Lyse de acordo com as instruções do manuscrito. Raspe o prato e transfira o lise para o tubo de ensaio de 1,5 mililitro. Em seguida, limpe o lise por centrifugação a 15.000 x g por cinco minutos e colete o supernatante.
Prepare contas magnéticas não rotuladas lavando-as três vezes com 500 microliters de tampão fosfato citrato. Após a lavagem final, remova o tampão e adicione a célula lysate às contas. Gire a mistura a 50 RPM por 30 minutos em temperatura ambiente.
Realize a separação magnética no suporte magnético e colete o lisecelular. Para ligar as proteínas alvo às contas conjugadas da imunoglobulina, coloque as contas no suporte magnético por cinco minutos. Descarte o tampão citrato e adicione a célula lysate às contas.
Gire a mistura por uma hora a 50 RPM. Para separar as proteínas-alvo das proteínas não-alvo gratuitas, lave as contas três vezes com 500 microliters de tampão fosfato citrato contendo 1% de polisorbato 20. Após a lavagem final, adicione 30 microliters de tampão citrato, e deixe as contas sentarem por cinco minutos à temperatura ambiente para elutar as proteínas alvo.
Para preparar a membrana, corte as membranas PVDF em pedaços de 3 milímetros por 3 milímetros usando tesouras cirúrgicas que foram limpas imediatamente antes do uso. Coloque os pedaços de membrana sobre a folha de alumínio e adicione dois a cinco microliters de etanol a cada peça. Antes que as membranas estejam completamente secas, adicione dois a cinco microlitradores do eluente proteico a cada peça e o ar seque-os até que a superfície da membrana fique fosca.
Em seguida, transfira as membranas em tubos de 1,5 mililitro e armazene-as a quatro graus Celsius. Se usar imediatamente, adicione dois a 30 microliters de etanol que os tornarão hidrofílicos. Remova o etanol com uma pipeta, mas antes que as membranas sequem, adicione completamente 200 microliters de solução de reação baseada em DTT a cada tubo, e incuba-os a 56 graus Celsius por uma hora.
Após a incubação, substitua a solução de reação por 300 microliters de solução de iodoacetamida e incuba no escuro por 45 minutos. Em seguida, lave as membranas duas vezes com água destilada e uma com 2% de acetonitrilo por vórtice por pelo menos dez segundos. Trabalhar com acetonitrila relacionada a diafragm pode ser extremamente perigoso.
Uma máscara, óculos e luvas devem ser sempre usados ao realizar o procedimento de digestão na membrana. Prepare a trippsina de acordo com as instruções do manuscrito, e adicione 100 microliters de solução de reação de trippsina a cada membrana. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius para digestão.
No dia seguinte, transfira a solução de reação para um tubo limpo de 1,5 mililitro e adicione 100 microliters de soluções de lavagem à membrana. Incubar a membrana a 60 graus Celsius por duas horas, depois coletar a solução de lavagem e misturá-la com a solução de reação. Adicione mais 100 microliters de solução de lavagem à membrana e sonicá-la por 10 minutos.
Em seguida, colete a solução de lavagem e misture-a com a solução de reação. Cubra o tubo de ensaio com um pedaço de filme de laboratório e faça pequenos buracos no filme com uma agulha. Seque a solução usando um concentrador de vácuo e dissolva o resíduo em 10 microlitres de ácido fórmico de 2%.
Centrifugar o tubo a 12.000 x g por três minutos, e transfira o supernatante em um tubo de amostra. Analise a amostra usando um espectrômetro de massa ligado a um sistema nano LC/HPLC. Por meio deste protocolo, foram identificadas 17 proteínas no imunoprecipitante associado à Calpain-6, 15 no imunoprecipitante associado ao GFP e 11 em ambas.
É importante notar que a detecção de pelo menos um fragmento de peptídeo de alta fidelidade é necessária para identificação positiva de uma proteína candidata. Proteínas que precipitaram no liceu expresso em GFP, bem como histones, proteínas exógenas e ribossômicas foram omitidas da lista. Lavar as membranas antes da digestão tripptica com água destilada e 2% de acetonitrilo é o passo mais importante no procedimento de digestão on-membrana sobre proteínas.
Seguindo este método, é possível confirmar a co-precipitação da proteína alvo realizando outros experimentos, como imunoprecipitação e análise de manchas ocidentais. Este método simples permite que os pesquisadores explorem as novas interações proteína-proteína com análises convenientes e altamente sensíveis.
