La ricerca dell'interazione proteina-proteina è indispensabile per comprendere i processi fisiologici in diversi campi. In questo video introduciamo la tecnica di digestione su membrana che consente ai ricercatori di eseguire un'analisi completa delle proteine leganti da parte della SM in modo conveniente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che possiamo migliorare la produttività dell'analisi proteomica per gli immunoprecipitanti grezzi perché non è necessaria la separazione delle proteine per elettroforesi del gel di poliacrilammide.
Inizia a coniugare l'anticorpo con le perline magnetiche, mescolando l'anticorpo anti-GFP con le perline in 500 microlitri di tampone fosfato di citrato. Ruotare la miscela a 50 giri/min per un'ora a temperatura ambiente. E poi lavare le perline coniugate tre volte con tampone di fosfato citrato contenente l'1%di polisorbato 20.
Lisci celle trasfette secondo le indicazioni manoscritte. Raschiare il piatto e trasferire il lysate nella provetta da 1,5 millilitri. Quindi sgombrato il lisato centrifugando a 15.000 x g per cinque minuti e raccogliere il supernatante.
Preparare perline magnetiche non etichettate lavandole tre volte con 500 microlitri di tampone fosfato di citrato. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il tampone e aggiungere il lysate cellulare alle perline. Ruotare la miscela a 50 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente.
Eseguire la separazione magnetica sul supporto magnetico e raccogliere il lisato cellulare. Per legare le proteine bersaglio alle perline coniugate con immunoglobulina, posizionare le perline sul supporto magnetico per cinque minuti. Scartare il buffer del citrato e aggiungere il lisato della cella alle perline.
Ruotare la miscela per un'ora a 50 giri/min. Per separare le proteine bersaglio dalle proteine libere non bersaglio, lavare le perline tre volte con 500 microlitri di tampone di fosfato di citrato contenente l'1%di polisorbato 20. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 microlitri di tampone di citrato e lasciare riposare le perline per cinque minuti a temperatura ambiente per elutare le proteine bersaglio.
Per preparare la membrana, tagliare le membrane PVDF in pezzi da 3 millimetri per 3 millimetri utilizzando forbici chirurgiche che sono state pulite immediatamente prima dell'uso. Posizionare i pezzi di membrana su un foglio di alluminio e aggiungere da due a cinque microlitri di etanolo a ciascun pezzo. Prima che le membrane siano completamente asciutte, aggiungere da due a cinque microlitri della proteina eluente a ciascun pezzo e asciugarli all'aria fino a quando la superficie della membrana diventa opaca.
Quindi trasferire le membrane in tubi da 1,5 millilitri e conservarle a quattro gradi Celsius. Se si utilizza immediatamente, aggiungere da due a 30 microlitri di etanolo che li renderanno idrofili. Rimuovere l'etanolo con una pipetta, ma prima che le membrane si asciughi, aggiungere completamente 200 microlitri di soluzione di reazione a base di DTT a ciascun tubo e incubarli a 56 gradi Celsius per un'ora.
Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione di reazione con 300 microlitri di soluzione di iodoacetamide e incubare al buio per 45 minuti. Quindi lavare le membrane due volte con acqua distillata e una volta con il 2%acetonitrile con vortice per almeno dieci secondi. Lavorare con acetonitrile correlato al diafano può essere estremamente pericoloso.
Una maschera, occhiali e guanti devono sempre essere indossati quando si esegue la procedura di digestione su membrana. Preparare la tripside secondo le indicazioni manoscritte e aggiungere 100 microlitri di soluzione di reazione alla tripina ad ogni membrana. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius per la digestione.
Il giorno successivo, trasferire la soluzione di reazione in un tubo pulito da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di soluzioni di lavaggio alla membrana. Incubare la membrana a 60 gradi Celsius per due ore, quindi raccogliere la soluzione di lavaggio e mescolarla con la soluzione di reazione. Aggiungere altri 100 microlitri di soluzione di lavaggio alla membrana e sonicarla per 10 minuti.
Quindi raccogliere la soluzione di lavaggio e mescolarla con la soluzione di reazione. Coprire la provetta con un pezzo di pellicola da laboratorio e fare piccoli fori nel film con un ago. Asciugare la soluzione utilizzando un concentratore sottovuoto e sciogliere il residuo in 10 microlitri di acido formico al 2%.
Centrifugare il tubo a 12.000 x g per tre minuti e trasferire il supernatante in un tubo campione. Analizzare il campione utilizzando uno spettrometro di massa collegato a un sistema nano LC/HPLC. Utilizzando questo protocollo, 17 proteine sono state identificate nell'immunoprecitante associato Calpain-6, 15 nell'immunoprecipite associato alla GFP e 11 in entrambi.
È importante notare che il rilevamento di almeno un frammento peptidico ad alta fedeltà è necessario per l'identificazione positiva di una proteina candidata. Le proteine che precipitarono nel lisato che esprimeva la GFP così come gli istoni, le proteine esogene e ribosomiali furono omesse dalla lista. Lavare le membrane prima della digestione triptica con acqua distillata e 2%acetonitrile è il passo più importante nella procedura di digestione su membrana sulle proteine.
Seguendo questo metodo, è possibile confermare la co-precipitazione della proteina bersaglio conducendo altri esperimenti, come l'immunoprecipitazione e l'analisi western blot. Questo semplice metodo consente ai ricercatori di esplorare le nuove interazioni proteina-proteina con analisi convenienti e altamente sensibili.
