חקר האינטראקציה בין חלבון לחלבון הוא הכרחי להבנת תהליכים פיזיולוגיים במספר תחומים. בסרטון זה אנו מציגים טכניקת עיכול על הממברנה המאפשרת לחוקרים לבצע ניתוח מקיף של חלבונים מחייבים על ידי טרשת נפוצה בצורה נוחה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לשפר את התפוקה של ניתוח פרוטומי עבור immunoprecipitants גולמי כי הפרדת חלבונים על ידי אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide אינו הכרחי.
התחל באוב את הנוגדן אל חרוזים מגנטיים, על ידי ערבוב נוגדן נגד GFP עם חרוזים ב 500 microliters של חיץ ציטראט פוספט. סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את חרוזים מצומדים שלוש פעמים עם חיץ פוספט ציטראט המכיל 1%polysorbate 20.
ליס תפור תאים לפי הוראות כתב יד. מגרדים את המנה ומעבירים את הליטאזט למבחנה של 1.5 מיליליטר. ואז לנקות את lysate על ידי צנטריפוגה ב 15, 000 x g במשך חמש דקות ולאסוף את העל טבעי.
הכינו חרוזים מגנטיים ללא חגורה על ידי שטיפתם שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטרים של חיץ ציטראט פוספט. לאחר הכביסה הסופית, להסיר את המאגר ולהוסיף lysate תא חרוזים. סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
בצע הפרדה מגנטית על מעמד מגנטי ולאסוף את התא lysate. כדי לקשור את חלבוני המטרה לחרוזים המצומדים אימונוגלובולין, מניחים את חרוזים על מעמד מגנטי במשך חמש דקות. השלך את מאגר הציטראט והוסף את lysate התא אל חרוזים.
מסובבים את התערובת במשך שעה ב-50 סל"ד. כדי להפריד חלבוני מטרה מחלבונים חופשיים שאינם יעד, לשטוף את חרוזים שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ פוספט ציטראט המכיל 1%polysorbate 20. לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים 30 מיקרוליטרים של חיץ ציטראט, ולתת את חרוזים לשבת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לחמק חלבוני היעד.
כדי להכין את הממברנה, לחתוך קרום PVDF לתוך 3 מילימטר על ידי חתיכות 3 מילימטר באמצעות מספריים כירורגיים שנוקו מיד לפני השימוש. מניחים את חתיכות הממברנה על רדיד אלומיניום ומוסיפים שניים עד חמישה מיקרוליטרים של אתנול לכל חתיכה. לפני שהממברנות יבשות לחלוטין, מוסיפים שניים עד חמישה מיקרוליטרים של החלבון אלבנט לכל חתיכה ומייבשים אותם באוויר עד שמשטח הממברנה הופך מט.
ואז להעביר ממברנות לתוך 1.5 צינורות מיליליטר ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס. אם משתמשים מיד, מוסיפים שניים עד 30 מיקרוליטרים של אתנול אשר יגרום להם הידרופילי. הסר את האתנול עם פיפטה, אבל לפני הממברנות להתייבש, להוסיף לחלוטין 200 microliters של פתרון תגובה מבוסס DTT לכל צינור, ו דגירה אותם ב 56 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר הדגירה, להחליף את פתרון התגובה עם 300 microliters של פתרון iodoacetamide, דגירה בחושך במשך 45 דקות. לאחר מכן לשטוף את הממברנות פעמיים עם מים מזוקקים ופעם אחת עם 2% אצטוניטריל על ידי מערבולת לפחות עשר שניות. עבודה עם אצטוניטריל הקשורות diaphanous יכול להיות מסוכן מאוד.
מסכה, משקפיים וכפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת ביצוע הליך העיכול על קרום. הכינו טריפסין לפי הוראות כתב היד, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון תגובת טריפסין לכל קרום. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס לעיכול.
למחרת, להעביר את פתרון התגובה לתוך צינור נקי 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 100 microliters של פתרונות לשטוף את הממברנה. דגירה הממברנה ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ולאחר מכן לאסוף את פתרון לשטוף ומערבבים אותו עם פתרון התגובה. מוסיפים עוד 100 מיקרוליטרים של פתרון כביסה לממברנה ומניקים אותו במשך 10 דקות.
לאחר מכן לאסוף את פתרון לשטוף ולערבב אותו עם פתרון התגובה. מכסים את המבחנה עם פיסת סרט מעבדה ולעשות חורים קטנים בסרט עם מחט. יבש את הפתרון באמצעות רכז ואקום, ולהמיס את השאריות ב 10 microliters של 2% חומצה פורמית.
צנטריפוגה הצינור ב 12, 000 x גרם במשך שלוש דקות, ולהעביר את supernatant לתוך צינור מדגם. נתח את הדגימה באמצעות ספקטרומטר מסה המקושר למערכת ננו LC/HPLC. באמצעות פרוטוקול זה, זוהו 17 חלבונים ב- Calpain-6 הקשורים immunoprecipitant, 15 ב immunoprecipitant הקשורים GFP, ו 11 זוהו בשניהם.
חשוב לציין כי זיהוי של שבר פפטיד אחד לפחות בנאמנות גבוהה נדרש לזיהוי חיובי של חלבון מועמד. חלבונים שזירזו את ליסאט GFP המביע כמו גם היסטון, חלבונים אקסוגניים וריבוזומליים הושמטו מהרשימה. שטיפת הממברנות לפני עיכול טריפטי במים מזוקקים ו-2% אצטוניטריל היא הצעד החשוב ביותר בהליך העיכול על הממברנה על חלבונים.
בעקבות שיטה זו, ניתן לאשר משקעים שותף של חלבון היעד על ידי ביצוע ניסויים אחרים, כגון immunoprecipitation וניתוח כתם מערבי. שיטה פשוטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את אינטראקציות החלבון-חלבון החדשות עם ניתוח נוח ורגיש.
